一种突变的HPPD多肽及其应用制造技术

本发明专利技术提供了抗除草剂基因、多肽及其在植物育种中的应用，具体地，本发明专利技术提供了一种突变的HPPD多肽及其应用，并且所述突变的HPPD多肽与亲本HPPD多肽相比，在对应于SEQ ID No.1第207位、第75位、第228位、第333位、第27位、第45位、第148位氨基酸的任意一位或任意几位发生突变。突变后的HPPD多肽对除草剂具有很强的耐受性，在提高和培育抗HPPD抑制性除草剂耐受性植物领域中具有非常广阔的应用前景。性植物领域中具有非常广阔的应用前景。性植物领域中具有非常广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种突变的HPPD多肽及其应用


[0001]本专利技术属于农业基因工程领域，具体涉及向植物赋予HPPD抑制性除草剂抗性或耐受性的新型突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)、其编码核酸以及应用。

技术介绍

[0002]对羟基苯丙酮酸双加氧酶(4
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Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase，HPPD，EC 1.13.11.27)是生物体内酪氨酸代谢过程中重要的酶，几乎存在于所有需氧的生物体中，生物体内酪氨酸(Tyrosine)在酪氨酸氨基转移酶(Tyrosine aminotransferase,TAT)的作用下生成对羟基苯丙酮酸(p
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hydroxyphenylpyruvic acid,HPPA)，在氧气的参与下HPPD能够将HPPA催化转化成尿黑酸(homogentisate，HGA)。在动物体内，HPPD的主要作用是促进酪氨酸、芳氨酸、苯丙氨酸的分解代谢。但在植物体内的作用与动物体内显著不同，尿黑酸进一步形成质体醌(plastoquinones)和生育酚(tocopherols，维生素E)(Ahrens et al.,2013)。生育酚起膜相关抗氧化剂的作用，是植物生长必须的抗氧化剂，能有效地增强植物的抗逆性。质体醌是植物进行光合作用过程中的关键辅助因子，促进植物体内类胡萝卜素等的合成。植物体中60％以上的叶绿素都结合于捕光天线复合物上，该复合物吸收太阳光能并将激发能传递给光合作用反应中心，而类胡萝卜素是反应中心的叶绿素结合蛋白和天线系统的重要组成部分，在植物光合作用中担负着光吸收辅助色素的重要功能，具有吸收和传递电子的能力，并在清除自由基方面起着重要作用。
[0003]HPPD受到抑制会导致植物细胞内的光合作用解偶联、辅助捕光色素缺乏，同时由于缺乏通常由类胡萝卜素提供的光保护作用，活性氧中间体和光氧化导致叶绿素破坏，结果造成植物光合作用组织产生白化症状，生长受到抑制，直至死亡(Beaudegnies et al.,2009)。
[0004]自20世纪90年代起被确定为除草剂靶标，HPPD是继乙酰乳酸合成酶(ALS)、5
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烯醇丙酮莽草酸
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磷酸合成酶(EPSPS)和乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)后又一重要的除草剂作用靶标，其独特的作用机制可以有效防治多种抗性杂草。HPPD类除草剂是近年来兴起的一类热销产品，具有高效、低毒、环境相容性好以及对后茬作物安全性高等一系列优点。研究发现植物与哺乳动物HPPD氨基酸序列的同源性存在显著差异，而同为植物界或者动物界的同源性比较高(Yang et al.,2004)。这为后续开发具有更高选择性和安全性的HPPD类除草剂提供了理论指导基础。目前，按结构分类已经开发了5种以HPPD为靶标的除草剂，主要包括三酮类、吡唑酮类、异噁唑类、二酮腈类和二苯酮类。
[0005]然而，这些HPPD抑制除草剂在杀死杂草的同时也会给作物带来一定的伤害，不同农作物对不同的HPPD除草剂的耐受程度不同，也限制了HPPD除草剂的使用范围，因此获得耐受除草剂的作物尤为重要。目前的策略除了试图绕过HPPD介导的尿黑酸产生外，还包括过表达该酶从而在植物中产生大量的除草剂靶标酶，减轻除草剂的抑制作用。虽然HPPD的过表达使得植物对除草剂(如异噁氟草的二酮腈衍生物)有更好的萌发前耐受性，但该耐受性不足以抵抗萌发后的除草剂处理。
[0006]CRISPR/Cas基因编辑技术是近几年新兴的基因工程技术，其是由guideRNA介导的DNA切割技术，针对Cas的不同已经开发出多种编辑系统，包括Cas9、Cpf1、Cms1、C2c1、C2c2等。CRISPR/Cas编辑技术可以实现三种定点编辑：第一种是基因的定点敲除，Cas蛋白在靶向RNA(gRNA)的指导下识别和切割靶点，产生双链DNA断裂；断裂的DNA通常以非同源末端连接(NHEJ)来修复；在修复时容易产生移码突变以破坏这个基因。定点敲除的效率都较高。第二种是对靶标进行同源置换来更换靶标序列或者定点插入。在产生双链DNA断裂时，如果在附近存在同源修复模板，这时可能发生同源置换或定点插入。同源置换的效率较低，并随着要置换的序列的长度增长而变得更低。第三种是单碱基编辑。单碱基编辑是利用CRISPR/Cas系统将脱氨酶靶向基因组中特定的位点从而对特定碱基进行修饰的基因编辑方法。此种方法已经在水稻中成功运用。
[0007]HPPD类除草剂大规模使用的时间较短，目前关于HPPD基因自身突变产生抗性的报道极少。但结合CRISPR技术，我们可以加快抗性HPPD多肽的筛选，改进作物对HPPD抑制剂的耐受性。对于扩大除草剂使用范围、延长使用寿命具有重要意义。

技术实现思路

[0008]本专利技术目的是提供一种可提高植物对HPPD抑制性除草剂产生抗性或耐受性的突变型HPPD多肽；本专利技术还涉及突变型HPPD的生物学活性片段，编码所述蛋白或片段的多核苷酸及其应用。
[0009]一方面，本专利技术提供了一种对羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)的突变多肽，所述突变多肽与亲本对羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第27位、第45位、第75位、第148位、第207位、第228位、第333位。
[0010]在另一优选例中，所述的突变为氨基酸的插入、缺失或替换。
[0011]在一个实施方式中，所述的突变为氨基酸的替换。
[0012]在另一优选例中，所述的突变多肽为除草剂抗性/耐受性多肽，尤其是针对HPPD抑制剂类除草剂的抗性/耐受性。
[0013]在一个实施方式中，所述第27位、第45位、第75位、第148位、第207位、第228位和第333位氨基酸位点分别为R、Q、A、A、G、V和A。
[0014]在一个实施方式中，所述第27位氨基酸突变为非R的氨基酸，例如，A，V，G，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，S，T，C，P，H，L，I；优选，H。
[0015]在一个实施方式中，所述第45位氨基酸突变为非Q的氨基酸，例如，A，V，G，K，F，W，Y，D，N，E，L，M，S，T，C，P，H，R，I；优选，R。
[0016]在一个实施方式中，所述第75位氨基酸突变为非A的氨基酸，例如，V，G，L，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，S，T，C，P，H，R，I；优选，V。
[0017]在一个实施方式中，所述第148位氨基酸突变为非A的氨基酸，例如，V，G，L，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，S，T，C，P，H，R，I；优选，T。
[0018]在一个实施方式中，所述第207位氨基酸突变为非G的氨基酸，例如，V，A，L，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，S，T，C，P，H，R，I；优选，S，W，T，Q，P，N。
[0019]在一个实施方式中，所述第228位氨基酸突变为非V的氨基酸，例如，A，G，L，Q，F，W，<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)的突变多肽，其特征在于，所述突变型的HPPD多肽选自以下I
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III任意一组：I、所述突变多肽与亲本对羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第207位、第75位、第228位、第333位、第27位、第45位、第148位；II、与I所述的突变型的HPPD多肽相比，具有I中所述的突变位点；并且，与I所述的突变型的HPPD多肽相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的突变型的HPPD多肽，并且保留了除草剂抗性的活性；III、与I所述的突变型的HPPD多肽相比，具有I中所述的突变位点；并且，与I所述的突变型的HPPD多肽相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，并且保留了除草剂抗性的活性。2.根据权利要求1所述的突变多肽，其特征在于，所述第207位氨基酸突变为非G的氨基酸；所述第75位氨基酸突变为非A的氨基酸；所述第228位氨基酸突变为非V的氨基酸；所述第333位氨基酸突变为非A的氨基酸；所述第27位氨基酸突变为非R的氨基酸；所述第45位氨基酸突变为非Q的氨基酸；所述第148位氨基酸突变为非A的氨基酸。3.根据权利要求1
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2任一所述的突变多肽，其特征在于，所述突变多肽还包括其他的对除草剂产生抗性的氨基酸位点；优选地，所述其他的对除草剂产生抗性的氨基酸位点包括对应于SEQ IDNo.1所示氨基酸序列的第54位、第401位、或第133位中的一个或多个位点。4.根据权利要求1
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3任一所述的突变多肽，其特征在于，所述亲本HPPD来源于单子叶植物或双子叶植物。5.根据权利要求4所述的突变多肽，其特征在于，所述亲本HPPD来源于水稻。6.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含权利要求1
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5任一所述的突变多肽。7.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1
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5任一所述的突变多肽或权利要求6所述的融合蛋白。8.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体含有权利要求7所述的多核苷酸；任选的，还含有与之可操作连接的调控元件；优选地，所述调控元件选自下组中的一种或任意几种：增强子、转座子、启动子、终止子、前导序列、多核苷酸序列、标记基因。9.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括权利要求1
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5任一所述的突变...

【专利技术属性】
技术研发人员：张金山，董颖慧，牛小牧，苏飞，李峰，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：