一种鸭坦布苏病毒病、鸭病毒性肝炎病毒二联三价卵黄抗体的制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种鸭坦布苏病毒病、鸭病毒性肝炎病毒二联三价卵黄抗体的制备方法和应用。包括制备鸭坦布苏病毒抗原液、I型鸭肝炎病毒抗原液和Ⅲ型鸭肝炎病毒抗原液的步骤，制备疫苗的步骤，鸡场蛋鸡免疫程序的建立的步骤以及，制备高免蛋卵黄抗体的步骤。本发明专利技术针对鸭坦布苏病毒、鸭病毒性肝炎病毒提供了一种特异性高、副反应低、外源污染低、操作简单的免疫原，同时也获得了易于制备和疗效好的鸭坦布苏病毒病、鸭病毒性肝炎病毒二联三价卵黄抗体，该抗体能够有效对其病毒进行中和，为鸭坦布苏病毒病、I型和Ⅲ型病毒性肝炎的防控起到积极作用。本发明专利技术还涉及一种前述卵黄抗体在进行鸭坦布苏病毒病、鸭病毒性肝炎病毒的免疫及治疗中的应用。中的应用。中的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种鸭坦布苏病毒病、鸭病毒性肝炎病毒二联三价卵黄抗体的制备方法和应用


[0001]本专利技术属于兽用疫苗
，涉及一种鸭坦布苏病毒病、鸭病毒性肝炎病毒二联三价卵黄抗体的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]鸭病毒性肝炎是由鸭甲型肝炎病毒引起的雏鸭高度致死性、传播迅速的病毒性疾病，一年四季均可发生，多以冬季易发，潜伏期短，病程短。对雏鸭的感染率高，死亡率各异。临床出现角弓反张症状后迅速死亡，剖检多见肝脏肿胀、出血或者坏死。鸭病毒性肝炎有3个独立的血清型，其中I型和Ⅲ型之间无交叉中和反应。鸭坦布苏病毒病是由坦布苏病毒引起的鸭的生殖、免疫和神经系统性传染病，潜伏期短，病程短，鸭日龄越小，临床症状越明显，死亡率越高。临床症状多表现为仰翻、侧翻等神经症状，剖检病变为卵泡变形、出血、破裂睾丸萎缩，脾脏早期肿大。
[0003]因鸭坦布苏病毒病和鸭病毒性肝炎具有发病率高、传播速度块、发病范围广等特性，而实际养殖过程中，环境差，生物安全系数低，使得卵黄抗体成为一种有效的潜在的治疗手段。经调研发现，鸭坦布苏病毒病多以胚体为研究对象展开卵黄抗体的研究，免疫原制备成本高、操作繁琐，未根据市场检测状况及时对鸭坦布苏病毒和病毒性肝炎病提供一针的防控策略。

技术实现思路

[0004]本专利技术为解决公知技术中存在的技术问题而提供一种鸭坦布苏病毒病、鸭病毒性肝炎病毒二联三价卵黄抗体的制备方法，本专利技术通过蚊源细胞系增殖鸭坦布苏病毒，鸡胚增殖I型鸭肝炎病毒和鸭胚增殖Ⅲ型鸭肝炎病毒开展研究，针对这两种病毒提供一种特异性高、副反应低、外源污染低、操作简单的免疫原，同时也获得了易于制备和疗效好的鸭坦布苏病毒病、鸭病毒性肝炎病毒二联三价卵黄抗体，该抗体能够有效对其病毒进行中和，为鸭坦布苏病毒病、I型和Ⅲ型病毒性肝炎的防控起到积极作用。
[0005]本专利技术为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是：一种鸭坦布苏病毒病、鸭病毒性肝炎病毒二联三价卵黄抗体的制备方法包括以下步骤，
[0006]步骤一，制备鸭坦布苏病毒抗原液；
[0007]S1、蚊源C6/36细胞转瓶培养；
[0008]使用转瓶培养蚊源C6/36细胞，培养基选取为蚊源细胞用培养基，培养条件为温度27℃及5％浓度CO2，每3天进行传代，传代后细胞密度为3～5
×
106cells/ml；
[0009]S2、病毒液的制备；
[0010]将实验室分离得到的鸭坦布苏病毒按照0.05％的剂量同步接种于1.5～4
×
105cells/ml的细胞悬液中，在温度27℃及5％浓度的CO2的条件下贴壁生长96～144小时，根据细胞病变程度收获细胞病毒液；
[0011]S3、收获抗原液；
[0012]将细胞病毒液置于
‑
20℃的温度条件下冻存一次，取出融化后于冷藏条件下、在3000rpm条件下离心15分钟，收集上清液后，使用30KD膜包进行5～10倍浓缩，使鸡胚效力检测控制在10
6.0
～10
6.5
ELD
50
/0.1ml；
[0013]S4、对鸭坦布苏病毒抗原液进行灭活并保存；
[0014]将检验合格的抗原液置于灭菌容器内，以终浓度1
‰
的比例加入甲醛，在37℃的温度条件下灭活24小时，灭活后置于2～8℃的温度条件下保存；
[0015]S5、对鸭坦布苏病毒抗原液进行冻干并保存；
[0016]将收获的抗原液与1％SPGA溶液等比例混合后分装，每瓶2ml，冻干结束后置于
‑
20℃的温度条件下行保存；
[0017]步骤二，制备I型鸭肝炎病毒抗原液；
[0018]S1、接种Ⅰ型鸭肝炎病毒；
[0019]将实验室分离筛选得到的免疫原性良好的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒经SPF鸡胚多次传代后，获得的一株稳定的、免疫原性好的鸡胚适应疫苗制备毒株，于尿囊腔接种9～10日龄的SPF鸡胚，接种量为0.1ml/枚，弃去48小时以内死亡的鸡胚，观察48～120小时，收获尿囊液；
[0020]S2、收获Ⅰ型鸭肝炎病毒抗原液；
[0021]将48～120小时死亡的鸡胚放于冷藏室，消毒后收获尿囊液，在3000rpm的条件下离心20分钟后，使用截留量为30KD的膜包进行过滤；
[0022]S3、对Ⅰ型鸭肝炎病毒抗原液进行灭活并保存；
[0023]将检验合格的抗原液置于灭菌容器内，以终浓度1
‰
的比例加入甲醛，在37℃的温度条件下灭活24小时，灭活后置于2～8℃的温度条件下保存；
[0024]步骤三，制备Ⅲ型鸭肝炎病毒抗原液；
[0025]S1、接种Ⅲ型鸭肝炎病毒；
[0026]将实验室分离得到的免疫原性良好的Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒尿囊腔接种11～12日龄的SPF鸭胚，接种量为0.1ml/枚，弃去48小时以内死亡的鸭胚，观察48～120小时，收获尿囊液；
[0027]S2、收获Ⅲ型鸭肝炎病毒抗原液；
[0028]将48～120小时死亡的鸭胚放于冷藏室，消毒后收获尿囊液，在3000rpm的条件下离心20分钟后，使用截留量为30KD的膜包进行过滤；
[0029]S3、对Ⅲ型鸭肝炎病毒抗原液进行灭活并保存；
[0030]将检验合格的抗原液置于灭菌容器内，以终浓度1
‰
的比例加入甲醛，在37℃的温度条件下灭活24小时，灭活后置于2～8℃的温度条件下保存；
[0031]步骤四，制备疫苗；
[0032]S1、油相制备；
[0033]取白油95份，加入1份硬脂酸铝，混合均匀并加热至80℃后，再加入5份司本80，完全溶解后，在121℃的温度条件下维持30分钟；
[0034]S2、水相制备；
[0035]取效价符合要求的灭活抗原液，按照鸭坦布苏病毒抗原液：I型鸭肝炎病毒抗原
液：Ⅲ型鸭肝炎病毒抗原液为1～3:1～3:2～5的比例关系进行配比并充分混匀；
[0036]S3、制备疫苗；
[0037]取2份油相置于乳化罐中，缓慢加入1份水相，再以8000rpm的条件乳化10分钟，乳化后取10ml，以3000rpm的条件离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml，定量分装并加盖密封，置于2～8℃的温度条件下保存；
[0038]步骤五，建立鸡场蛋鸡免疫程序；
[0039]S1、免疫鸡只；
[0040]选择100日龄的产蛋鸡进行免疫，首次免疫：将鸭坦布苏病毒病冻干苗肌肉注射健康产蛋鸡，每只注射量为0.5ml；二次免疫：首次免疫二周后用二联三价灭活疫苗颈部皮下注射健康产蛋鸡，每只注射量为2.0ml；三次免疫：二次免疫三周后，胸部肌肉多点注射二联三价灭活疫苗，每只注射量为2.0ml；四次免疫：三次免疫三周后，腿部皮下注射二联三价灭活疫苗，每只注射量为1.0ml；维持免疫：根据抗体效价，隔2～3个月后再加强接种1次，每只注射量为2.0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鸭坦布苏病毒病、鸭病毒性肝炎病毒二联三价卵黄抗体的制备方法，其特征是：包括以下步骤，步骤一，制备鸭坦布苏病毒抗原液；S1、蚊源C6/36细胞转瓶培养；使用转瓶培养蚊源C6/36细胞，培养基选取为蚊源细胞用培养基，培养条件为温度27℃及5％浓度CO2，每3天进行传代，传代后细胞密度为3～5
×
106cells/ml；S2、病毒液的制备；将实验室分离得到的鸭坦布苏病毒按照0.05％的剂量同步接种于1.5～4
×
105cells/ml的细胞悬液中，在温度27℃及5％浓度的CO2的条件下贴壁生长96～144小时，根据细胞病变程度收获细胞病毒液；S3、收获抗原液；将细胞病毒液置于
‑
20℃的温度条件下冻存一次，取出融化后于冷藏条件下、在3000rpm条件下离心15分钟，收集上清液后，使用30KD膜包进行5～10倍浓缩，使鸡胚效力检测控制在10
6.0
～10
6.5
ELD
50
/0.1ml；S4、对鸭坦布苏病毒抗原液进行灭活并保存；将检验合格的抗原液置于灭菌容器内，以终浓度1
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的比例加入甲醛，在37℃的温度条件下灭活24小时，灭活后置于2～8℃的温度条件下保存；S5、对鸭坦布苏病毒抗原液进行冻干并保存；将收获的抗原液与1％SPGA溶液等比例混合后分装，每瓶2ml，冻干结束后置于
‑
20℃的温度条件下行保存；步骤二，制备I型鸭肝炎病毒抗原液；S1、接种Ⅰ型鸭肝炎病毒；将实验室分离筛选得到的免疫原性良好的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒经SPF鸡胚多次传代后，获得的一株稳定的、免疫原性好的鸡胚适应疫苗制备毒株，于尿囊腔接种9～10日龄的SPF鸡胚，接种量为0.1ml/枚，弃去48小时以内死亡的鸡胚，观察48～120小时，收获尿囊液；S2、收获Ⅰ型鸭肝炎病毒抗原液；将48～120小时死亡的鸡胚放于冷藏室，消毒后收获尿囊液，在3000rpm的条件下离心20分钟后，使用截留量为30KD的膜包进行过滤；S3、对Ⅰ型鸭肝炎病毒抗原液进行灭活并保存；将检验合格的抗原液置于灭菌容器内，以终浓度1
‰
的比例加入甲醛，在37℃的温度条件下灭活24小时，灭活后置于2～8℃的温度条件下保存；步骤三，制备Ⅲ型鸭肝炎病毒抗原液；S1、接种Ⅲ型鸭肝炎病毒；将实验室分离得到的免疫原性良好的Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒尿囊腔接种11～12日龄的SPF鸭胚，接种量为0.1ml/枚，弃去48小时以内死亡的鸭胚，观察48～120小时，收获尿囊液；S2、收获Ⅲ型鸭肝炎病毒抗原液；将48～120小时死亡的鸭胚放于冷藏室，消毒后收获尿囊液，在3000rpm的条件下离心20分钟后，使用截留量为30KD的膜包进行过滤；
S3、对Ⅲ型鸭肝炎病毒抗原液进行灭活并保存；将检验合格的抗原液置于灭菌容器内，以终浓度1
‰
的比例加入甲醛，在37℃的温度条件下灭活24小时，灭活后置于2～8℃的温度条件下保存；步骤四，制备疫苗；S1、油相制备；取白油95份，加入1份硬脂酸铝，混合均匀并加热至80℃后，再加入5份司本80，完全溶解后，在121℃的温度条件下维持30分钟；S2、水相制备；取效价符合...

【专利技术属性】
技术研发人员：李娥，崔松奇，张文芳，饶潇君，余海涛，刘兴刚，张良，柴沛瑶，李晓静，崔学毅，
申请(专利权)人：豪威生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：