羊驼和骆驼血液中纳米抗体的提取鉴定和开发应用制造技术

本发明专利技术涉及纳米抗体技术领域，具体为羊驼和骆驼血液中纳米抗体的提取鉴定和开发应用，包括：蛋白提取，所述血样用UA裂解法提取蛋白质，所述采用BCA进行蛋白质定量；蛋白溶液内酶解，所述血样中蛋白质酶解后采用MCX对肽段进行脱盐，肽段冻干后加入40μL0.1％甲酸溶液复溶，肽段定量，质谱上机，所述质谱上机采用纳升级流速HPLC液相系统Easy nLC进行分离，所述样品上样到色谱柱Thermo scientific EASY column，再经分析柱分离。本发明专利技术在骆驼和羊驼血液中均鉴定到了纳米抗体，且纳米抗体的表达量存在差异，可以看出骆驼中纳米抗体的表达量远大于羊驼，这说明骆驼可以更容易获取到纳米抗体，可以将骆驼作为提取天然纳米抗体的主要来源。来源。来源。

【技术实现步骤摘要】
羊驼和骆驼血液中纳米抗体的提取鉴定和开发应用


[0001]本专利技术涉及纳米抗体
，具体为羊驼和骆驼血液中纳米抗体的提取鉴定和开发应用。

技术介绍

[0002]纳米抗体是缺失轻链的天然重链抗体的可变区组成的单域抗体，与传统抗体相比具有相对分子质量小(约15kDA)、亲和力高、特异性强、稳定性高、体内组织渗透性好以及人源化简单等特点。
[0003]纳米抗体可以作为疾病诊断与检测的工具，同时纳米抗体药物也具有广阔的发展前景。但快速稳定的分离出高亲和力的抗体是很难实现的。纳米抗体相对分子质量小仅为常规抗体的1/10左右，因常规的蛋白组学方法会损失一些低丰度信号，所以无法鉴定到纳米抗体。而4D
‑
labelfree是新一代蛋白质组学分析技术，在鉴定准度、鉴定深度、定量准确性、检测周期等性能上有了全面的提升，因此定性和定量数据更稳定，可以准确的鉴定到小分子物质。现今大多数纳米抗体的制备都是通过在骆驼体内分离出重链抗体，经PCR扩增获得全套重链抗体可变区基因，而后将其克隆至载体，而后在体外表达获得纳米抗体库，骆驼和羊驼同属于骆驼科且体内均存在纳米抗体，因常规蛋白组学方法无法检测到分子量小的纳米抗体，所以目前并没有其在动物体内表达量的研究，因此亟需设计羊驼和骆驼血液中纳米抗体的提取鉴定和开发应用来解决上述问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供羊驼和骆驼血液中纳米抗体的提取鉴定和开发应用，以解决上述
技术介绍
中提出的骆驼和羊驼同属于骆驼科且体内均存在纳米抗体，因常规蛋白组学方法无法检测到分子量小的纳米抗体，所以目前并没有其在动物体内表达量的研究的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案，羊驼和骆驼血液中纳米抗体的提取鉴定，包括：
[0006]蛋白提取，
[0007]所述血样用UA(8MUrea，100mMTris/HCl，pH8.5)裂解法提取蛋白质，所述采用BCA(Bio
‑
Rad，USA)进行蛋白质定量；
[0008]蛋白溶液内酶解，
[0009]所述血样裂解后采用MCX(MCXuElutionPlate30um)对肽段进行脱盐，肽段冻干后加入40μL0.1％甲酸溶液复溶，肽段定量(OD280)；
[0010]质谱上机，
[0011]所述质谱上机采用纳升级流速HPLC液相系统EasynLC进行分离，所述样品上样到色谱柱ThermoscientificEASYcolumn(2cm*100μm5μm
‑
C18)，再经分析柱ThermoscientificEASYcolumn(75μm*100mm3μm
‑
C18)分离，流速为300nL/min，肽段经色谱
分离后使用timsTOFPro质谱仪(4D
‑
labelfree)进行质谱分析；
[0012]查库，
[0013]所述质谱分析原始数据为采用Peaks软件进行查库鉴定及定量分析；
[0014]纳米抗体及相关肽段的鉴定，
[0015]所述骆驼血液中鉴定到了2种纳米抗体，所述羊驼血液中鉴定到1种纳米抗体。
[0016]优选的，所述血样裂解后的样品每个取20μg蛋白分别与5Xloadingbuffer混合，煮沸5min，在12.5％的SDS
‑
PAGE凝胶上(恒流14mA，90min)分离，考马斯亮蓝R
‑
250染色显示蛋白条带。
[0017]优选的，所述血样裂解的各样品取200μg蛋白质，加入8MUA，室温1h，加入DTT至终浓度为100mM，600rpm震荡1min，室温孵育1h，加入IAAbuffer(50mMIAAinUA)，600rpm振荡1min，室温避光反应30min，加入100mMNH4HCO3溶液，将8MUA稀释至2M。加入40μLTrypsinbuffer(4μgTrypsinin40μL25mMNH4HCO3)，600rpm振荡1min，37℃放置16
‑
18h。加入TFA酸化，调pH至3左右。
[0018]优选的，所述缓冲液成分为:A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)，色谱柱以95％的A液平衡，所述缓冲液相关液相梯度如下:1小时梯度:0min
‑
50min，B液线性梯度从0％
‑
35％；50min
‑
55min，B液线性梯度从35％
‑
100％；55min
‑
60min，B液维持在100％。
[0019]优选的，所述质谱上机时长为60min，且检测方式为正离子，离子源电压设置为1.5kV，MS及MSMS均用TOF进行检测和分析，所述质谱扫描范围设置为100
‑
1700m/z，所述数据采集模式采用平行累积串行碎裂(PASEF)模式，一张一级质谱采集后进行10次PASEF模式采集母离子，一个循环窗口时间为1.17秒，电荷数在0
‑
5范围内的二级谱图，串联质谱扫描的动态排除时间设置为24秒避免母离子的重复扫描。
[0020]羊驼和骆驼血液中纳米抗体的开发应用：
[0021]所述骆驼和羊驼血液中均鉴定到了纳米抗体，且纳米抗体的表达量存在差异，所述骆驼中纳米抗体的表达量远大于羊驼，所述骆驼可以更容易获取到纳米抗体，所述将骆驼作为提取天然纳米抗体的主要来源。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0023]1、骆驼和羊驼的纳米抗体与抗原结合能力强、特异性高，是很好的抗病抗病毒因子，纳米抗体的独特优势使其在基础研究、新药开发以及疾病的诊断和治疗以及食品科学领域均具有广阔的应用和发展前景，在骆驼和羊驼血液中均鉴定到了纳米抗体，且纳米抗体的表达量存在差异，可以看出骆驼中纳米抗体的表达量远大于羊驼，这说明骆驼可以更容易获取到纳米抗体，可以将骆驼作为提取天然纳米抗体的主要来源。
[0024]1、使用4D
‑
labelfree技术从羊驼和骆驼的血液中提取并鉴定到了天然纳米抗体，纳米抗体的表达量在两物种间存在差异。
附图说明
[0025]图1为本专利技术纳米抗体表达量柱形图示意图。
具体实施方式
[0026]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0027]请参阅图1，本专利技术提供的一种实施例：
[0028]羊驼和骆驼血液中纳米抗体的提取鉴定和开发应用，包括：
[0029]蛋白提取，
[0030]血样用UA(8MUrea，100mMTris/HCl，pH8.5)裂解法提取蛋白质，然后采用BCA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.羊驼和骆驼血液中纳米抗体的提取鉴定，其特征在于，包括：蛋白提取，所述血样用UA(8MUrea，100mMTris/HCl，pH8.5)裂解法提取蛋白质，所述采用BCA(Bio
‑
Rad，USA)进行蛋白质定量；蛋白溶液内酶解，所述血样中蛋白质酶解后采用MCX(MCXuElutionPlate30um)对肽段进行脱盐，肽段冻干后加入40μL0.1％甲酸溶液复溶，肽段定量(OD280)；质谱上机，所述质谱上机采用纳升级流速HPLC液相系统Easy nLC进行分离，所述样品上样到色谱柱Thermo scientific EASYcolumn(2cm*100μm5μm
‑
C18)，再经分析柱Thermo scientific EASY column(75μm*100mm3μm
‑
C18)分离，流速为300nL/min，肽段经色谱分离后使用timsTOF Pro质谱仪(4D
‑
labelfree)进行质谱分析；查库，所述质谱分析的原始数据采用Peaks软件进行查库鉴定及定量分析；纳米抗体及相关肽段的鉴定，所述骆驼血液中鉴定到了2种纳米抗体，所述羊驼血液中鉴定到1种纳米抗体。2.根据权利要求1所述的羊驼和骆驼血液中纳米抗体的提取鉴定，其特征在于：所述血样裂解后的样品每个取20μg蛋白分别与5Xloading buffer混合，煮沸5min，在12.5％的SDS
‑
PAGE凝胶上(恒流14mA，90min)分离，考马斯亮蓝R
‑
250染色显示蛋白条带。3.根据权利要求1所述的羊驼和骆驼血液中纳米抗体的提取鉴定，其特征在于：所述血样裂解的各样品取200μg蛋白质，加入8MUA，室温1h，加入DTT至终浓度为100mM，600rpm震荡1min，室温孵育1h，加入IAA buffer...

【专利技术属性】
技术研发人员：王泽英，徐亚男，郭素平，胡玉苗，岳奎华，梁晓龙，张宇，秦宇婷，顾铭，陈芮，孙迎港，吴彦智，乔艳军，张秋，李茜，汪小微，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：