一种检测维生素B1在全血中活性代谢产物硫胺素二磷酸浓度的方法技术

本发明专利技术提供了一种检测维生素B1(VB1)在全血中活性代谢产物硫胺素二磷酸(TDP)浓度的方法。该方法经蛋白沉淀预处理，使用液相色谱串联质谱(LC

【技术实现步骤摘要】
一种检测维生素B1在全血中活性代谢产物硫胺素二磷酸浓度的方法


[0001]本专利技术属于检验分析
，具体涉及一种检测维生素B1(VB1)在全血中活性代谢产物硫胺素二磷酸(TDP)浓度的方法。

技术介绍

[0002]维生素B1(Vitamin B1，thiamin)又称硫胺素，还可以称之为抗神经炎素。属于水溶性维生素，以盐的形式被利用。主要以4种形式在体内存在，分别是：游离的硫胺素、硫胺素一磷酸(TMP)、硫胺素二磷酸(TDP)和硫胺素三磷酸(TTP)。全血中TDP的LC/MS
‑
MS分析是确定硫胺素营养状况的最灵敏、最特异性和最精确的方法，是全身储备的可靠指标。血清或血浆硫胺素检测的敏感性和特异性较差，血浆中含有的硫胺素不到10％。因此，有必要开展一种维生素B1在全血中检测TDP浓度的方法，以此来评估体内维生素B1的浓度。
[0003]2020年申请的中国专利(申请号:202010172197.2)公开了一种“超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中9种水溶性维生素的试剂盒”的方法，2019年合肥谱佳医学检验实验室有限公司申请的中国专利(申请号:201911234804.7)公开了一种基于液相色谱串联质谱技术的维生素B1和维生素C浓度快速检测方法的方法，二者均检测的是血清中硫胺素的浓度，而不是体内的活性代谢产物硫胺素二磷酸，血浆或者血清硫胺素浓度反映的是最近的摄入量而不是身体储存量；全血是硫胺素评估的首选样本。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种检测全血中TDP浓度的方法。该方法经蛋白沉淀预处理，加入pH调节剂得到样本进样溶液，使用液相色谱串联质谱(LC
‑
MS/MS)对目标物进行分析，本方法单样本所需液质分析时间仅1.5min，极大的增加了检测通量；前处理简单，易于操作，同时该专利技术提取回收率高，灵敏度高，无明显基质效应，满足多个型号质谱检测设备的定量需求，可应用于临床检测工作中。
[0005]本专利技术所提供的检测全血中TDP浓度的方法，包括如下步骤：
[0006]对待测含TDP的全血样品进行前处理，得到目标样品溶液；
[0007]对所述目标样品溶液的TDP进行检测，计算全血样品中TDP的浓度。
[0008]其中，所述对含TDP的全血样品进行前处理得到目标样品溶液的操作为：
[0009]收集待测含TDP的全血样品，经冻融循环后加入内标溶液，涡旋震荡，加入沉淀剂，涡旋混匀，离心，取上清液，加入pH调节剂，混匀，即得到目标样品溶液。
[0010]所述对所述目标样品溶液的TDP进行测试，计算全血样品中TDP的浓度的步骤包括：
[0011]配制含不同的已知浓度的TDP的标准曲线样本溶液，并绘制所述标准曲线样本溶液的标准曲线；
[0012]使用高效液相色谱串联质谱对所述目标样品溶液进行测试，根据所述标准曲线得
出所述目标样品溶液中的TDP的含量，从而得到待测含TDP的全血样品中的TDP的含量；
[0013]所述配置含不同的已知浓度的TDP的标准曲线样本溶液，并绘制所述标准曲线样本溶液的标准曲线的步骤包括：
[0014]首先分别配制含不同的已知浓度的TDP的标准曲线样本，加入内标溶液，涡旋震荡，加入沉淀剂，涡旋混匀，离心，取上清液，加入pH调节剂，混匀，即得到一系列含不同的已知浓度的TDP的标准曲线样本溶液；
[0015]其次，使用高效液相色谱串联质谱对所述标准曲线样本溶液进行测试，计算TDP和内标峰面积比值，通过内标法建立标准曲线。
[0016]上述方法中，所述内标溶液为TDP
‑
d3溶液，0.8
‑
1.6nmol/L；
[0017]待测含TDP的全血样品或标准曲线样本与内标溶液的体积比为10：1；
[0018]pH调节剂的浓度为10％
‑
40％的氨水溶液；
[0019]待测含TDP的全血样品或标准曲线样本与pH调节剂的体积比为8:1
‑
9:1
[0020]待测含TDP的全血样品或标准曲线样本与沉淀溶液的体积比为1:0.6
‑
1：3；
[0021]沉淀溶液为三氯乙酸，高氯酸和偏磷酸溶液；
[0022]沉淀溶液的浓度为3％
‑
10％；
[0023]加入pH调节剂和沉淀溶液后涡旋混匀的条件为2000rpm下进行5min；
[0024]所述离心的条件可为15000g，4℃，离心5分钟；
[0025]所述稀释液具体可为pH 2
‑
4的水溶液；
[0026]所述TDP标曲的空白基质为0.01M PBS和牛血清白蛋白(BSA)混合水溶液；
[0027]所述牛血清白蛋白(BSA)的浓度为4％
‑
5％；
[0028]液相色谱条件为：色谱柱：Waters,Atlantis Premier BEH C182.5μm 2.1
×
100mm；柱温40℃；进样器温度4℃；流动相A为0.05％氨水(含1mmol/L甲酸铵)，B为乙腈，等度洗脱：0
‑
1.5min，流动相B为5％；流速为0.3mL/min；进样量3μL。
[0029]质谱参数为：ESI+；气帘气(CUR):30psi；；喷雾电压(IS):5500V；温度(TEM):400℃；雾化气(Gas1):50psi；辅助加热气(Gas2):50psi；多反应检测(MRM)；
[0030]表1TDP具体质谱参数
[0031][0032]*为定量离子
[0033]所述标准曲线的TDP定量范围为：10nmol/L
‑
1000nmol/L。
[0034]本专利技术的有益效果在于：
[0035](1)本专利技术从临床实际需求出发，采用蛋白沉淀的预处理方式。可操作性更强，更符合临床的需求，建立了一种同时定性定量的方法，有利于检测标准的统一，有较好的灵敏度，定量下限为10nmol/L，可适用于多种质谱设备的检测需求；极大的降低了临床应用及科研成本；
[0036](2)本专利技术中液质分析时间仅为1.5min，即可达到基线分离，无杂峰干扰，极大的增加了临床实验室的检测通量。
[0037]本专利技术的检测方法符合验证要求，并对标曲溶液稳定性进行考察，更符合临床的
需求。
[0038]本专利技术从临床实际需求出发，采用蛋白沉淀和pH调节剂预处理，LC
‑
MS/MS分析时间1.5min，极大的增加了检测通量；同时该专利技术符合“2020版《中国药典》
‑
9012生物样品定量分析方法验证指导原则”和《液相色谱
‑
质谱临床应用建议(指南与共识)》(中华检验医学杂志,2017,40(10):770
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779)方法学要求，提取回收率高，灵敏度高，满足多个型号质谱检测设备的定量本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测维生素B1(VB1)在全血中活性代谢产物硫胺素二磷酸(TDP)浓度的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：对待测含VB1的全血样品进行前处理，得到目标样品溶液；对所述目标样品溶液的TDP进行测试，计算全血样品中TDP的浓度；其中，所述对含VB1的全血样品进行前处理得到目标样品溶液的操作为：收集待测含维生素B1的全血样品，经冻融循环后加入内标溶液，涡旋震荡，加入沉淀剂，涡旋混匀，离心，取上清液，加入pH调节剂，混匀，即得到目标样品溶液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述对所述目标样品溶液的TDP进行测试，计算全血样品中TDP的浓度的步骤包括：配制含不同的已知浓度的TDP的标准曲线样本溶液，并绘制所述标准曲线样本溶液的标准曲线；使用高效液相色谱串联质谱对所述目标样品溶液进行测试，根据所述标准曲线得出所述目标样品溶液中的TDP的含量，从而得到待测含TDP的全血样品中的TDP的含量。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述配置含不同的已知浓度的TDP的标准曲线样本溶液，并绘制所述标准曲线样本溶液的标准曲线的步骤包括：首先分别配制含不同的已知浓度的TDP的标准曲线样本，加入内标溶液，涡旋震荡，加入沉淀剂，涡旋混匀，离心，取上清液，加入pH调节剂，混匀，即得到一系列含不同的已知浓度的TDP的标准曲线样本溶液；其次，使用高效液相色谱串联质谱对所述标准曲线样本溶液进行测试，计算TDP和内标峰面积比值，通过内标法建立标准曲线。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其特征在于：所述内标溶液为TDP
‑
d3...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵福荣，王琳，李莹，王璐，崔颖，蒋玉新，关丽萍，曹云峰，
申请(专利权)人：大连博源医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：