一种结直肠癌多基因甲基化的检测试剂盒制造技术

本发明专利技术一种结直肠癌多基因甲基化的检测试剂盒，其通过检测结直肠癌基因甲基化检测位点包括FBXO5、eIF6、KIF2C、IGF2BP3、CBX3、ALKBH5、Septin9的甲基化情况，能够使检测结果具有较高的准确度，而DNA甲基化异常通常发生在癌症早期，因此DNA甲基化指标的检测可作为结直肠癌早期筛查、诊断、预后评估的重要指标；且通过结合NGS测序，能够进一步提高检测的准确度。确度。确度。

【技术实现步骤摘要】
一种结直肠癌多基因甲基化的检测试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种结直肠癌多基因甲基化的检测试剂盒。

技术介绍

[0002]DNA甲基化(DNA methylation)为DNA化学修饰的一种形式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现，对个体的生长、发育、基因表达模式以及基因组的稳定性起到重要的调控作用，并且这种修饰在发育和细胞增殖的过程中是可以稳定传递的。近年来的大量研究表明，DNA异常甲基化与肿瘤的发生、发展、细胞癌变有着密切的联系。肿瘤DNA甲基化的变化表现在基因组总体甲基化水平的降低和某一些基因启动子区域CpG岛甲基化水平的升高；抑癌基因和DNA修复基因的甲基化使得抑癌基因沉默和修复基因失活，因而对于肿瘤的抑制作用丧失，同时基因损伤增加；而基因组总体甲基化水平的降低，使原癌基因和反转录转座子活化，染色体稳定性下降。
[0003]结直肠癌是全球范围内最为常见的恶性肿瘤之一，在我国结直肠癌发病率逐年提高。根据美国国家癌症研究中心数据，结直肠癌5年生存率可达90.6％，而转移性结直肠癌5年生存率仅为14.7％，由此可见结直肠癌早筛的重要性；其不仅与个人利益相关，同时对国家医疗、疾病负担上有一定的减轻。然而受到科技因素的限制，迄今为止我国尚未建立完善的、稳定的结直肠癌早筛技术。
[0004]目前，结直肠癌医院筛查的策略是基于化学法(guaiac FOBT，gFOBT)、免疫法(fecal immunochemical test，FIT)、结肠镜检查、循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)、Septin9基因甲基化等循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)标志物、血液及粪便的RNA与蛋白标志物、粪便菌群标志物、尿液标志物检查等筛查方法。
[0005]其中：化学法(gFOBT)筛查肿瘤及进展期腺瘤的灵敏度较低，易受饮食成分影响，假阳性率与假阴性率较高。免疫法(FIT)，灵敏度高，但特异度较低；检测癌前病变的灵敏度也高，但是检测方法的成本相对较高。结肠镜检查是结直肠癌筛查的金标准，在早期诊疗癌前病变中起到了不可替代的作用，但结肠镜检查作为一项有创检查，成本高，所需准备较为烦琐，且具有一定穿孔(3.1/10 000)与大出血(14.6/10 000)的风险，患者依从性较差。循环肿瘤细胞(CTC)、Septin9基因甲基化等循环肿瘤DNA(ctDNA)标志物、血液及粪便的RNA与蛋白标志物、粪便菌群标志物、尿液标志物等，这些方法在灵敏度、特异度、准确度上都存在不可避免的问题。此外，目前虽然有对一些基因进行甲基化检测，但主要是针对单一基因进行甲基化检测，对此可能存在一定的假阳性结果，对患者预测的准确性、特异性、灵敏度降低；其次在进行甲基化检测大多数技术还是通过medip
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qpcr方法进行检测，此方法误差较大。
[0006]由鉴于此，研发出一种灵敏度、特异性和准确性均较高的结直肠癌检测方式是本行业人员所迫切需要的。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种结直肠癌多基因甲基化的检测试剂盒，其具有较高的灵敏度、特异性和准确性。
[0008]本专利技术是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种结直肠癌多基因甲基化的检测试剂盒，所述试剂盒所检测的结直肠癌基因甲基化检测位点包括FBXO5、eIF6、KIF2C、IGF2BP3、CBX3、ALKBH5、Septin9；且该试剂盒包括如下引物对：
[0009]1)、FBXO5甲基化检测的引物对包括如SEQ ID NO.1
‑
8所示的引物对1、引物对2、引物对3、及引物对4；
[0010]2)、eIF6甲基化检测的引物对包括如SEQ ID NO.9
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18所示的引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、及引物对9；
[0011]3)、KIF2C甲基化检测的引物对包括如SEQ ID NO.19
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28所示的引物对10、引物对11、引物对12、引物对13、及引物对14；
[0012]4)、IGF2BP3甲基化检测的引物对包括如SEQ ID NO.29
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36所示的引物对15、引物对16、引物对17、及引物对18；
[0013]5)、CBX3甲基化检测的引物对包括如SEQ ID NO.37
‑
42所示的引物对19、引物对20、及引物对21；
[0014]6)、ALKBH5甲基化检测的引物对包括如SEQ ID NO.43
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50所示的引物对22、引物对23、及引物对25；
[0015]7)、Septin9甲基化检测的引物对包括如SEQ ID NO.51
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54所示的引物对26与引物对27。
[0016]进一步地，所述试剂盒的检测样本类型为离体的血液样本。
[0017]进一步地，所述试剂盒是通过NGS检测检测位点的甲基化状态。
[0018]本专利技术的有益效果在于：
[0019](1)、本专利技术试剂盒具有高灵敏度和特异性；且其对结直肠癌进行多基因甲基化检测，能够使检测结果具有较高的准确度，而DNA甲基化异常通常发生在癌症早期，因此DNA甲基化指标的检测可作为结直肠癌早期筛查、诊断、预后评估的重要指标；
[0020](2)、本专利技术7个基因检测位点的基因甲基化情况是通过NGS测序获得的，能够进一步提高检测的准确度。
【附图说明】
[0021]下面参照附图结合实施例对本专利技术作进一步的描述。
[0022]图1是本专利技术实施例四中7种基因甲基化程度预测结直肠癌ROC曲线；
[0023]图2是本专利技术实施例四中Septin9甲基化程度预测结直肠癌ROC曲线。
【具体实施方式】
[0024]通过以下具体实施例对本专利技术进行详细描述，以使本领域技术人员能够容易说明书的公开内容实施本专利技术。本专利技术所描述的实施例仅是示例性的，且不用于限制本专利技术。另外，除非特别说明，本专利技术中所采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议条件实施；且本发
明中所采用的样本均为离体样本。
[0025]实施例一筛选甲基化检测位点
[0026]本专利技术甲基化检测位点进行筛选的数据来源于公共数据库TCGA甲基化数据、以及对应样本的临床信息；采用逻辑回归、岭回归(LASSO)、RFECV
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SVM(SVM)、RFECV
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RF(RF)算法实现对基因筛选、评估；逻辑回归与岭回归使用分层交叉验证进行参数优选，设定特征选择的阈值为特征权重的平均值，即特征权重大于平均值的特征将会被保留；而RFECV算法则使用不同的学习模型SVM、RF进行筛选。具体筛选步骤如下：
[0027](1)、从TCGA官网下载直肠癌甲基化数据本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种结直肠癌多基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒所检测的结直肠癌基因甲基化检测位点包括FBXO5、eIF6、KIF2C、IGF2BP3、CBX3、ALKBH5、Septin9；且该试剂盒包括如下引物对：1)、FBXO5甲基化检测的引物对包括如SEQ ID NO.1
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8所示的引物对1、引物对2、引物对3、及引物对4；2)、eIF6甲基化检测的引物对包括如SEQ ID NO.9
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18所示的引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、及引物对9；3)、KIF2C甲基化检测的引物对包括如SEQ ID NO.19
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28所示的引物对10、引物对11、引物对12、引物对13、及引物对14；4)、IGF2BP3甲基化检测的引物对包括如SEQ ID NO.29
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36所示的引物对15、引物对16、引物对17、及引物对18；5)、CBX3甲基化检测的引物对包括如SEQ ID NO.37
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42所示的引物对19、引物对20、及引物对21；6)、ALKBH5甲基化检测的引物对包括如SEQ ID NO.43
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50所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：高明航，
申请(专利权)人：易瑞达福建生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：