不同miRNA作为牡丹发芽、开花研究中内参基因的应用及其筛选方法技术

本发明专利技术提供了不同miRNA作为牡丹发芽、开花研究中内参基因的应用及其筛选方法，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术通过qRT

【技术实现步骤摘要】
不同miRNA作为牡丹发芽、开花研究中内参基因的应用及其筛选方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及不同miRNA作为牡丹发芽、开花研究中内参基因的应用及其筛选方法。

技术介绍

[0002]牡丹(Paeonia suffruticosa)是我国的传统名花，栽培历史悠久，有着很高的观赏价值和药用价值。同时，牡丹种子富含油脂，籽油不饱和脂肪酸含量高，尤其富含亚麻酸，具有非常高的营养保健价值。近年来，qRT
‑
PCR技术越来越成为牡丹基因研究与分子育种的重要技术手段。而稳定的内参基因作为qRT
‑
PCR的重要前提，在牡丹的相关研究中也越来越重要。前人对牡丹在切花开放时期、低温处理的花芽等实验条件下的内参基因进行了筛选(王彦杰等.牡丹实时定量PCR分析中内参基因的选择.2012)，然而这些研究仅关注了几个看家基因，其候选内参基因数目设定较少，并且局限于花芽以及切花花瓣等的实验处理，对于许多牡丹研究方向尤其是油用牡丹研究的参考价值非常有限。同时，除了常见传统看家基因以外，对于牡丹新内参基因的挖掘很长时间以来仍属空白。并且，同一种内参基因常因物种、发育条件、环境胁迫等因素的差异，其表达稳定性存在显著差异，并不存在绝对稳定的万能内参基因。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供不同miRNA作为牡丹
‘
凤丹
’
和
‘
连鹤
’
发芽、开花研究中内参基因的应用及其筛选方法。
[0004]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0005]本专利技术提供了mtr
‑
MIR160b
‑
p3 miRNA和/或gma
‑
miR394a
‑
5p miRNA作为
‘
凤丹
’
牡丹芽发育过程中稳定表达的内参基因的应用，所述mtr
‑
MIR160b
‑
p3的序列为SEQ ID NO.7，所述gma
‑
miR394a
‑
5p的序列为SEQ ID NO.3。
[0006]本专利技术还提供了PC
‑
5p
‑
19095miRNA、gma
‑
miR394a
‑
5pmiRNA和/或mtr
‑
MIR160b
‑
p3 miRNA作为
‘
连鹤
’
牡丹芽发育过程中稳定表达的内参基因的应用，所述PC
‑
5p
‑
19095的序列为sEQ ID NO.17，所述gma
‑
miR394a
‑
5p的序列为SEQ ID NO.3，所述mtr
‑
MIR160b
‑
p3的序列为SEQ ID NO.7。
[0007]本专利技术还提供了mtr
‑
miR159a miRNA作为
‘
凤丹
’
牡丹或
‘
连鹤
’
牡丹花发育阶段花瓣中稳定表达的内参基因的应用，所述mtr
‑
miR159a的序列为SEQ ID NO.11。
[0008]本专利技术还提供了
‘
凤丹
’
牡丹盛开期不同组织器官中稳定表达的miRNA，包括PC
‑
3p
‑
871miRNA和PC
‑
5p
‑
4miRNA，所述PC
‑
3p
‑
871miRNA的序列为SEQ ID NO.8，所述PC
‑
5p
‑
4miRNA的序列为SEQ ID NO.4。
[0009]本专利技术还提供了PC
‑
3p
‑
871miRNA和/或PC
‑
5p
‑
4miRNA作为
‘
凤丹
’
牡丹盛开期不同组织器官中稳定表达的内参基因的应用。
[0010]本专利技术还提供了PC
‑
5p
‑
4miRNA和/或mtr
‑
miR168b miRNA作为在
‘
连鹤
’
牡丹盛开期不同组织器官中稳定表达的内参基因的应用，所述PC
‑
5p
‑
4内参基因的序列为SEQ ID NO.4，所述mtr
‑
miR168b内参基因的序列为SEQ ID NO.9。
[0011]本专利技术还提供了筛选牡丹miRNA内参基因的方法，包括以下步骤：
[0012](1)称取牡丹的组织样品，研磨，提取总miRNA；
[0013](2)利用步骤(1)中提取的miRNA反转录合成第一链cDNA；
[0014](3)选择U6和miRNAs作为miRNA表达标准化的候选参考基因；
[0015](4)设计miRNAs内参基因的正向引物；
[0016](5)以步骤(2)获得的第一链cDNA为模板，分别以步骤(3)中的候选参考基因的引物进行qRT
‑
PCR扩增获得扩增曲线；
[0017]所述qRT
‑
PCR扩增的体系，以20μL计，包括2ng/μL的一链模板2μL、10μM正向引物0.4μL，10μtM反向引物0.4μL，2
×
SYBR Green 10μL，所述qRT
‑
PCR扩增的程序包括：95℃变性30s，95℃5s，60℃30s，40个循环；
[0018](6)根据扩增曲线，使用ΔCt、GeNorm、Normfinder和BestKeeper分析候选参考miRNA的稳定性，筛选稳定性最好的miRNA作为内参基因。
[0019]优选的，所述miRNAs内参基因为mtr
‑
MIR160b
‑
p3、gma
‑
miR394a
‑
5p、PC
‑
3p
‑
70893、mtr
‑
miR171e
‑
3p、PC
‑
5p
‑
19095、PC
‑
3p
‑
871、mtr
‑
miR166a、mtr
‑
miR168b、PC
‑
5p
‑
74547、PC
‑
3p
‑
1770、PC
‑
3p
‑
25825、U6、PC
‑
5p
‑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.mtr
‑
MIR160b
‑
p3 miRNA和/或gma
‑
miR394a
‑
5p miRNA作为
‘
凤丹
’
牡丹芽发育过程中稳定表达的内参基因的应用，所述mtr
‑
MIR160b
‑
p3的序列为SEQ ID NO.7，所述grna
‑
miR394a
‑
5p的序列为SEQ ID NO.3。2.PC
‑
5p
‑
19095 miRNA、gma
‑
miR394a
‑
5p miRNA和/或mtr
‑
MIR160b
‑
p3 miRNA作为
‘
连鹤
’
牡丹芽发育过程中稳定表达的内参基因的应用，所述PC
‑
5p
‑
19095的序列为SEQ ID NO.17，所述gma
‑
miR394a
‑
5p的序列为SEQ ID NO.3，所述mtr
‑
MIR160b
‑
p3的序列为SEQ ID NO.7。3.mtr
‑
miR159a miRNA作为
‘
凤丹
’
牡丹或
‘
连鹤
’
牡丹花发育过程的花瓣中稳定表达的内参基因的应用，所述mtr
‑
miR159a的序列为SEQ ID NO.11。4.
‘
凤丹
’
牡丹盛开期不同组织器官中稳定表达的miRNA，其特征在于，包括PC
‑
3p
‑
871 miRNA和PC
‑
5p
‑
4 miRNA，所述PC
‑
3p
‑
871 miRNA的序列为SEQ ID No.8，所述PC
‑
5p
‑
4 miRNA的序列为SEQ ID NO.4。5.PC
‑
3p
‑
871 miRNA和/或PC
‑
5p
‑
4 miRNA作为
‘
凤丹
’
牡丹盛开期不同组织器官中稳定表达的内参基因的应用。6.PC
‑
5p
‑
4miRNA和/或mtr
‑
miR168bmiRNA作为在
‘
连鹤
’
牡丹盛开期不同组织器官中稳定表达的内参基因的应用，所述PC
‑
5p
‑
4内参基因的序列为SEQ ID NO.4，所述mtr
‑
m...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯小改，郭丽丽，张晨洁，宋程威，郭琪，李昱莹，沈佳佳，雷炀，高靖姗，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：