一种与虹鳟热应激相关的miRNA标志物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种与虹鳟热应激相关的miRNA标志物及其应用，属于生物检测技术领域。本发明专利技术通过细胞转染、双荧光素酶报告基因检测、细胞增殖、细胞凋亡、转染miR

【技术实现步骤摘要】
一种与虹鳟热应激相关的miRNA标志物及其应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种与虹鳟热应激相关的miRNA标志物及其应用。

技术介绍

[0002]热应激，表示生物体在高温下的非特异性生理反应，应激导致系统的生理和生物化学变化，它导致代谢失衡，破坏组织和器官。最近热应激在动物福利和健康方面的作用受到了相当大的关注。热应激会诱发复杂的反应，细胞中的热应激适应是一个复杂的多基因调控步骤。热应激改变了热休克蛋白的水平，这是参与生物体内细胞活动的关键分子伴侣。miRNAs是内源性的、非编码的RNA(长度为21
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23个核苷酸)，显示出高度保守的进化。它们通过作用于目标基因的ORF区域、3'
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UTR和5'
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UTR来促进目标基因的降解或抑制其翻译，从而调节基因水平。miRNAs调节与不同细胞过程有关的不同基因水平，并在转录后水平上进行控制。miRNA与复杂的生理事件如细胞发育、生长、分化、凋亡和免疫反应有关。此外，高度保守的哺乳动物miRNAs针对数百个mRNAs调节不同的重要生物事件。
[0003]虹鳟是一种经济型的冷水鱼。它的适宜生长温度为12℃～18
°
C，因此对高温敏感。暴露在25℃水温下的虹鳟肝细胞出现了坏死和凋亡的病理改变。现有的miR
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x过表达组荧光素酶活性下调且差异不显著，且对虹鳟肝细胞凋亡不具有促进作用。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种miR
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x过表达组荧光素酶活性下调且差异显著，且对虹鳟肝细胞凋亡具有促进作用的虹鳟热应激相关的miRNA标志物及其应用。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]一种与虹鳟热应激相关的miRNA标志物，包括细胞转染、双荧光素酶报告基因检测、细胞增殖、细胞凋亡、转染miR
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x热应激下hsp90a1 mRNA检测、转染miRNA后热应激处理、RT
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qPCR检测hsp90a1 mRNA表达、转染miR
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x后Western Blot检测Hsp90a1蛋白表达，所述RT
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qPCR检测hsp90a1 mRNA表达步骤为：向虹鳟肝细胞中转染miR
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x模拟物、miR
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x抑制物以及阴性对照，待48h稳定后，热处理4、8、12、24、48h后收集细胞提取RNA，检测hsp90a1 mRNA相对表达量。
[0007]作为优选，所述细胞转染包括如下步骤：
[0008]1)转染前先接种细胞到96孔板，接种方法同上细胞传代方法；
[0009]2)待细胞接种后生长密度达到80％
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90％时，进行转染；
[0010]3)转染前将上述各组重组质粒与转染试剂按照1:1比例混合制备复合物，用移液器吹吸10～15次混匀，室温静置10～15min；
[0011]4)将上述复合物加入到有完全培养基的HEK 293T细胞中，置于37℃，5％CO2培养箱培养；
[0012]5)对细胞进行24h换液及后续实验处理。
[0013]作为优选，所述双荧光素酶报告基因检测包括如下步骤：
[0014]1)将转染的96孔板从培养箱中取出，放置10min使培养板平衡至室温；
[0015]2)向96孔培养箱各孔加入与培养基等体积的萤火虫荧光素酶检测试剂，混合均匀；
[0016]3)避光静置15min，待细胞充分裂解后，在酶标仪上检测萤火虫荧光素酶发光信号；
[0017]4)从酶标仪取出，向各孔加入与初始培养基体积相同的海肾荧光素酶检测试剂，在水平摇床上混合均匀；
[0018]5)避光静置15min后，在酶标仪上检测海肾荧光素酶发光信号；
[0019]6)计算各孔萤火虫荧光素酶信号/海肾荧光素酶酶信号的比值，比值的大小反应了双荧光素酶活性的大小。
[0020]作为优选，所述细胞凋亡包括如下步骤：
[0021]1)将细胞收集于1.5mL离心管内，离心弃上清；
[0022]2)细胞沉淀用0.8mL细胞染色缓冲液重悬细胞；
[0023]3)加入5uL Hoechst染色液；
[0024]4)加入5uL PI染色液；
[0025]5)混匀，冰浴或4℃孵育20
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30min；
[0026]6)用流式细胞仪检测红色荧光和蓝色荧光。
[0027]作为优选，所述转染miR
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x热应激下hsp90a1 mRNA检测步骤为：将miR
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x模拟物、miR
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x抑制物以及阴性对照分别转染至虹鳟原代肝细胞中，待48h转染稳定后，将其转移至24℃中热处理4、8、12、24、48h，然后通过RT
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qPCR和Western Blot方法检测每个时间点hsp90a1 mRNA表达量和蛋白表达量，以此来验证热应激下miR
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x对靶基因hsp90a1 mRNA和蛋白的表达的影响。
[0028]作为优选，所述转染miRNA后热应激处理包括如下步骤：
[0029]1)将消化好的细胞均匀地铺在12孔板中，待细胞长满至60％
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70％开始转染；
[0030]2)将miR
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x模拟物、miR
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x抑制物、miR
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x阴性对照分别转染进虹鳟原代肝细胞中放入18℃、5％CO2培养箱中待48h稳定后进行下一步操作；
[0031]3)更换新的培养基后将细胞转移至24℃、5％CO2培养箱中开始热应激处理；
[0032]4)分别在热处理4、8、12、24、48h收集细胞；
[0033]5)将收集好的细胞提取RNA和蛋白。
[0034]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0035]1)本专利技术中的miR
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x过表达组荧光素酶活性下调且差异显著，miR
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x与hsp90a1存在靶向关系。
[0036]2)本专利技术中miR
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x过表达组靶基因hsp90a1的表达水平均显著降低48.05％(P<0.05)；miR
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种与虹鳟热应激相关的miRNA标志物，包括细胞转染、双荧光素酶报告基因检测、细胞增殖、细胞凋亡、转染miR
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x热应激下hsp90a1mRNA检测、转染miRNA后热应激处理、RT
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qPCR检测hsp90a1mRNA表达、转染miR
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x后WesternBlot检测Hsp90a1蛋白表达，其特征在于所述RT
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qPCR检测hsp90a1mRNA表达步骤为：向虹鳟肝细胞中转染miR
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x模拟物、miR
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x抑制物以及阴性对照，待48h稳定后，热处理4、8、12、24、48h后收集细胞提取RNA，检测hsp90a1mRNA相对表达量。2.根据权利要求1所述的一种与虹鳟热应激相关的miRNA标志物，其特征在于所述细胞转染包括如下步骤：1)转染前先接种细胞到96孔板，接种方法同上细胞传代方法；2)待细胞接种后生长密度达到80％
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90％时，进行转染；3)转染前将上述各组重组质粒与转染试剂按照1:1比例混合制备复合物，用移液器吹吸10～15次混匀，室温静置10～15min；(4)将上述复合物加入到有完全培养基的HEK293T细胞中，置于37℃，5％CO2培养箱培养；5)对细胞进行24h换液及后续实验处理。3.根据权利要求1所述的一种与虹鳟热应激相关的miRNA标志物，其特征在于所述双荧光素酶报告基因检测包括如下步骤：1)将转染的96孔板从培养箱中取出，放置10min使培养板平衡至室温；2)向96孔培养箱各孔加入与培养基等体积的萤火虫荧光素酶检测试剂，混合均匀；3)避光静置15min，待细胞充分裂解后，在酶标仪上检测萤火虫荧光素酶发光信号；4)从酶标仪取出，向各孔加入与初始培养基体积相同的海肾荧光素酶检测试剂，在水平摇床上混合均匀；5)避光静置15min后，在酶标仪上检测海肾荧光素酶发光信号；6)计算各孔萤火虫荧光素酶信号/海肾荧光素酶酶信号的比值，比值的...

【专利技术属性】
技术研发人员：权金强，刘哲，赵桂研，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：