一种利用二氯甲烷安全高效地提取土壤磷脂脂肪酸的方法技术

本发明专利技术属于生物安全技术领域，涉及一种利用二氯甲烷安全高效地提取土壤磷脂脂肪酸的方法。本发明专利技术利用二氯甲烷比同类氯代物稳定，毒性小的特点，通过使用二氯甲烷代替常规氯仿不仅大大提高了提取土壤磷脂脂肪酸（PLFA）的效率，而且对人体和环境更加健康、安全和友好。安全和友好。安全和友好。

【技术实现步骤摘要】
一种利用二氯甲烷安全高效地提取土壤磷脂脂肪酸的方法


[0001]本专利技术属于生物安全
，涉及一种利用二氯甲烷安全高效地提取土壤磷脂脂肪酸的方法。

技术介绍

[0002]从土壤中提取磷脂脂肪酸（PLFA）的传统方法采用氯仿：甲醇：柠檬酸盐=1：2：0.8比例进行提取，因该方法具有诸多优点而被广泛采用。然而氯仿已被列为一种可能的人类致癌物，对心、肝、肾有损害。在许多情况下，氯仿的使用已被限制或禁止。因此，研究出一种更安全的有机溶剂代替氯仿以减少对人体的危害势在必行。
[0003]二氯甲烷与氯仿的性质及其相似，一般情况下是可以互换的。对于特定的物质，两者的溶解度是有区别的，二者的沸点相差较大，且氯仿极性较大，但在土壤磷脂脂肪酸（PLFA）的提取中，氯仿只充当萃取剂的作用，溶解度和沸点对试验结果并无影响。虽然极性大的氯仿能提取出更多的脂肪酸碳链，但对于大多数的土壤而言，利用二氯甲烷完全足够提取出土壤中的磷脂，对于实验结果的分析并无影响。如果是相对贫瘠的土壤，可以适当选择用氯仿提取。
[0004]氯仿不仅对人体的伤害大，实验后氯仿废液的处理也要极其的仔细，否则对环境造成极大的污染。二氯甲烷比同类氯代物稳定，是氯代甲烷中毒性最小的。使用二氯甲烷代替氯仿提取土壤磷脂脂肪酸（PLFA）将会是对人体和环境更加健康、安全和友好的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是针对现有技术存在的上述问题，一种对人体和环境更加健康的利用二氯甲烷安全高效地提取土壤磷脂脂肪酸的方法本专利技术的目的可通过下列技术方案来实现：一种提取土壤磷脂脂肪酸的方法，所述方法包括如下步骤：S1、在土壤中依次加入柠檬酸缓冲液、二氯甲烷、甲醇进行浸提得浸提液；S2、将浸提液离心分离，重复步骤S1对离心后的底层土样进行第二次浸提，然后依次加入正己烷、异丙醇、水进行第三次浸提，合并三次浸提的浸提液；S3、在浸提液中加入柠檬酸缓冲液和二氯甲烷进行遮光静置，静置分层后取下层二氯甲烷溶液加入甲醇进行振荡，然后氮气吹干，再经SPE萃取柱进行提取得磷脂液；S4、在磷脂液中加入甲醇/甲苯混合液进行溶解，然后加入氢氧化钾甲醇溶液进行水浴加热，再加入正己烷/二氯甲烷混合液，添加醋酸和去离子水进行振荡离心，最后加入正己烷/异丙醇振荡离心，转移上层有机相，氮气吹干。
[0006]在上述的一种提取土壤磷脂脂肪酸的方法中，步骤S1柠檬酸缓冲液pH为4，具体为0.1
‑
0.2moL/L的柠檬酸钠水溶液和0.1
‑
0.2moL/L柠檬酸水溶液混合制得。
[0007]在上述的一种提取土壤磷脂脂肪酸的方法中，二氯甲烷中含有5
‑
10%(w/v) 的乙醇。本专利技术为了保证更高的脂肪酸提取效率，加入5
‑
10%（w/v）的乙醇防止磷脂脂肪酸的损
失，而且能够提高提取土壤磷脂脂肪酸的提取效率。
[0008]在上述的一种提取土壤磷脂脂肪酸的方法中，步骤S1柠檬酸缓冲液、二氯甲烷、甲醇的体积比为1：（1
‑
1.5）：（2
‑
3）。
[0009]作为优选，步骤S2正己烷、异丙醇、水的体积比为（5
‑
7）：（7
‑
9）：1.5。
[0010]在上述的一种提取土壤磷脂脂肪酸的方法中，步骤S3遮光静置时间为20
‑
24h。
[0011]在上述的一种提取土壤磷脂脂肪酸的方法中，步骤S3提取具体为：先用二氯甲烷洗SPE柱，将二氯甲烷溶液并转移到SPE柱中，再用二氯甲烷洗中性脂，加丙酮洗糖脂，加甲醇洗磷脂，加内标后氮气吹干。
[0012]在上述的一种提取土壤磷脂脂肪酸的方法中，内标为浓度30
‑
35ppm的十九烷酸甲酯溶液。自然界中微生物不含19:0的磷脂，所以用浓度30
‑
35ppm的十九烷酸甲酯溶液作为内标。
[0013]在上述的一种提取土壤磷脂脂肪酸的方法中，步骤S4甲醇/甲苯混合液中甲醇和甲苯的体积比为（0.8
‑
1.2）:1。
[0014]在上述的一种提取土壤磷脂脂肪酸的方法中，步骤S4氢氧化钾甲醇溶液浓度为0.1
‑
0.3moL/L。
[0015]在上述的一种提取土壤磷脂脂肪酸的方法中，步骤S4正己烷/二氯甲烷混合液中正己烷和二氯甲烷体积比为（2
‑
5）：1。
[0016]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术利用二氯甲烷比同类氯代物稳定，毒性小的特点，通过使用二氯甲烷代替常规氯仿不仅大大提高了提取土壤磷脂脂肪酸（PLFA）的效率，而且对人体和环境更加健康、安全和友好。
附图说明
[0017]图1为实施例1和对比例1提取土壤中磷脂脂肪酸碳链的响应值对比图。
[0018]图2为实施例1和对比例2提取土壤中磷脂脂肪酸PLFAs浓度对比图。
[0019]图3为实施例1和对比例3提取土壤中磷脂脂肪酸PLFAs浓度对比图。
实施方式
[0020]以下是本专利技术的具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的描述，但本专利技术并不限于这些实施例。
[0021]浓度0.15moL/L的柠檬酸缓冲液：0.15moL/L柠檬酸钠100mL（4.41g柠檬酸钠溶解于100mL去离子水中）和0.15moL/L柠檬酸溶液150mL（6.3g柠檬酸溶于200 mL去离子水中）混合，用柠檬酸溶液调pH到4。
[0022]内标：100ml浓度31ppm的内标溶液，需要称取内标纯品（十九烷酸甲酯）0.003100099887g溶于100毫升正己烷中。
[0023]正己烷/二氯甲烷混合液：60mL正己烷，15mL二氯甲烷。
[0024]甲醇甲苯混合液：体积比1:1。
[0025]浓度0.2moL/L的氢氧化钾甲醇溶液：0.56gKOH溶解在50 mL甲醇中。
[0026]浓度1M的冰醋酸：2.9mL溶解在50mL水中。
[0027]二氯甲烷：用乙醇稳定的二氯甲烷是通过蒸馏HPLC级二氯甲烷来去除其他杂质，
然后加入8%（w/v）乙醇来配制。
实施例
[0028]Day1：称取1.5g冷冻干燥酸性土样于50mL玻璃离心管中，按依次加入1.6mL柠檬酸缓冲液，2mL二氯甲烷，4mL甲醇，涡旋振荡；遮光下水平振荡2h（250rpm），离心（10min，1500rpm）。转移溶液至大号试管中，加入0.8mL柠檬酸缓冲液，1mL二氯甲烷，2mL甲醇，涡旋振荡，遮光下水平振荡2h（250rpm），离心（10min，1500rpm），完成第二次浸提，两次浸提液倒入同一大号试管中。再加3mL正己烷，4mL异丙醇，0.75mL水到浸提两次的土壤中，涡旋振荡，遮光下水平振荡2h（250rpm），离心（10min，1500rpm），洗脱液倒入到同一大号试管中，对土壤中的磷脂脂肪酸进行完全的洗脱，以实现磷脂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用二氯甲烷安全高效地提取土壤磷脂脂肪酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、在土壤中依次加入柠檬酸缓冲液、二氯甲烷、甲醇进行浸提得浸提液，S2、将浸提液离心分离，重复步骤S1对离心后的底层土样进行第二次浸提，然后依次加入正己烷、异丙醇、水进行第三次浸提，合并三次浸提的浸提液；S3、在浸提液中加入柠檬酸缓冲液和二氯甲烷进行遮光静置，静置分层后取下层二氯甲烷溶液加入甲醇进行振荡，然后氮气吹干，再经SPE萃取柱进行提取得磷脂液；S4、在磷脂液中加入甲醇/甲苯混合液进行溶解，然后加入氢氧化钾甲醇溶液进行水浴加热，再加入正己烷/二氯甲烷混合液，添加醋酸和去离子水进行振荡离心,最后加正己烷/异丙醇混合液进行振荡离心，转移上层有机相，氮气吹干。2.根据权利要求1所述的一种利用二氯甲烷安全高效地提取土壤磷脂脂肪酸的方法，其特征在于，步骤S1柠檬酸缓冲液pH为4，具体为0.1
‑
0.2moL/L的柠檬酸钠水溶液和0.1
‑
0.2moL/L柠檬酸水溶液混合制得。3.根据权利要求1所述的一种利用二氯甲烷安全高效地提取土壤磷脂脂肪酸的方法，其特征在于，二氯甲烷中含有5
‑
10%（w/v）的乙醇。4.根据权利要求1所述的一种利用二氯甲烷安全高效地提取土壤磷脂脂肪酸的方法，其特征在于，步骤S1柠檬酸缓冲液、二氯甲烷、甲醇...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖慧玲，李雅颖，王娟，姚槐应，
申请(专利权)人：宁波北仑中科海西产业技术创新中心，
类型：发明
国别省市：