PCR-免疫胶体金试纸条猪肉快速鉴定方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术涉及肉类食品的分子鉴定领域，是一种PCR

【技术实现步骤摘要】
PCR
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免疫胶体金试纸条猪肉快速鉴定方法及检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及肉类食品的分子鉴定领域，使用分子生物学技术及免疫技术建立可视化免疫胶体金试纸条猪肉与其易混品种快速鉴定方法及研发快速检测试剂盒。

技术介绍

[0002]肉类食品安全已经成为全球关注的公共安全问题。普通消费者难以通过感官分辨掺假肉，即使是执法部门在取证过程中目前也缺乏简便有效的技术手段，对掺假肉打击乏力。因此急需一种能够快速、准确鉴定肉类食品真实性、安全性的基因检测方法。
[0003]从20世纪80年代开始,国内外就已开展了动物源性成分检测相关的研究工作,目前,主要的检测方法包括:以显微镜观察为基础的物理方法、以检测蛋白质为基础的免疫学方法、以检测DNA为基础的分子生物学方法、以高效液相色谱技术为基础的化学方法、以近红外反射技术为基础的光谱学方法。其中,由于DNA分子受热加工的影响比较小，不易降解，对实验室设备及实验人员要求不高，因此，基于DNA的聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction,PCR)具有特异性强、灵敏度高、操作简便，结果客观准确等优点,已在肉制品掺假鉴别方面也显示出良好的应用前景。PCR技术国内用于食品的检测刚刚起步。是根据不同种属的基因序列设计特异性引物，利用PCR反应实现特异性基因片段的指数级扩增，通过凝胶电泳条带或荧光曲线鉴别食品中可能的物种来源。
[0004]本专利技术考虑用凝胶电泳条带或荧光曲线来检测结果还是需要贵重仪器的配合，不利于实地检测。因此本专利技术采用的免疫胶体金试纸条鉴定方法，不需要任何仪器的配合，具有成本低、快速、可视化的优点。更加适合实地快速检测。并且，试纸条的灵敏度高于凝胶电泳，因此，PCR扩增时，循环次数减到20个循环，即可检测到明显的结果。使检定方法更加快速、可靠。从而建立了猪肉PCR
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免疫胶体金试纸条快速鉴定方法。
[0005]为了使猪肉PCR
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疫胶体金试纸条鉴定方法更加快速，并且标准化、规范化，本专利技术研制了猪肉PCR
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疫胶体金试纸条快速检测试剂盒。本试剂盒的最大创新之处，一是将PCR反应体系中的上游引物、下游引物、TaqDNA聚合酶、dNTPs、缓冲液各组成成分，在浓度、剂量方面进行最佳的优化，并且装到一个PCR反应管中，操作者只需将提取的模板DNA 2ul 加入PCR反应管中，混匀后即可进行PCR扩增。并且经过反复试验，试剂的特异性、稳定性、重现性均非常好。二是试剂盒中提供相匹配的DNA提取试剂，以及阳性、阴性对照液，可以避免试剂配置的繁琐，购买太多试剂的浪费，以及防止不同来源试剂对实验结果造成影响，操作流程简便、快速，检测结果准确、可靠。三是解决了PCR扩增成败的关键即引物的设计问题，引物设计需要专业技术人员丰富的生物技术知识及熟练应用生物信息学软件的能力，本试剂盒中提供设计好的特异性引物，优化最佳浓度和退火温度，不依赖专业技术人员，任何人都可以通过使用流程精确的得到实验结果。四是运用分子克隆及基因测序技术，成功的克隆了猪肉DNA特异性基因片段，测序结果运用相似性搜索算法(BLAST)与靶基因进行序列比对分析，与猪mtDNA Cytb指纹区段DNA序列同源性达100％，并将此克隆液作为阳性对照液。阳性对照液直接以DNA的形式提供，直接反映了乳鹿独一无二的DNA序列，避免每次提取对照药
材时误差的产生，检测结果具有高度的稳定性、可靠性，重现性好、灵敏度高、样品用量少。而且阳性对照液以重组质粒的形式长期储存，使阳性对照液取之不尽用之不竭。同时节省大量的道地药材用于临床及节省大量经费。五是产物的结果检测采用免疫胶体金试纸条，只需2
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3分钟即可出现肉眼可见的检测结果，与琼脂糖凝胶电泳需要贵重仪器配合相比较，本法成本低廉、简单、快速。
[0006]本专利技术结合了PCR技术的特异性强、灵敏性高等特点，核酸试纸条的简便、快速、低成本等优势，试剂盒规范化、标准化特征。在普通实验室、普通的检测人员按照操作流程都可进行操作，最多2小时就可成功完成猪肉真伪鉴别的全部操作流程，更适合实地检测。此方法用于猪肉的鉴定未见相关报道因此，本专利技术具有一定的新颖性、创造性与实用性。
[0007]本专利技术可对肉类食品进行动物源性成分鉴定，对质量进行把关，为食品监督管理部门和肉类食品生产、经营企业裁决肉类制品质量提供可靠依据，为我国肉类食品质量控制的方法学研究提供崭新的平台，为肉类食品走向世界提供可信的质量监控技术。

技术实现思路

[0008]本专利技术采用生物信息学技术对猪的mtDNA基因组进行分析，利用Genbank中的相关信息，根据猪与其他相关动物的mtDNA基因组序列SNP位点的差异，选取Cytb基因作为特异性靶基因，应用primer 5.0设计软件，设计猪肉的特异性引物，利用PCR技术，在一个反应体系中加入一对猪肉的特异性引物，优化PCR反应体系及反应条件，针对猪肉的DNA模板序列,扩增出一段猪肉的特异的目的片段，利用免疫胶体金试纸条进行可视化检测，猪肉正品检测线(T 线)和质控线(C线)均出现条带，猪肉伪品只有质控线(C线)出现条带，从而可以准确有效快速地将猪肉及其易混品种从DNA水平上区分开来，具有特异、灵敏、简便、快捷、低成本、可视化的特点。并对猪肉基因组DNA提取试剂、PCR鉴定试剂及结果检测进行筛选和优化，克隆猪肉对照药材，进而研发出猪肉PCR
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免疫胶体金试纸条快速检测试剂盒，使猪肉的鉴定在普通实验室、普通的检测人员按照操作流程都可进行标准化、规范化操作。
[0009]本专利技术的目的是在于提供可视化试纸条猪肉与其易混品种的快速鉴定方法和快速检测试剂盒，建立一种特异、灵敏、简便、快速、准确、低成本、可视化的鉴定技术，提供一种适用于实地检测，标准化、规范化的检验技术。
[0010]本专利技术的目的是由以下技术方案来实现的：
[0011]一种PCR
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免疫胶体金试纸条猪肉快速鉴定方法，其特征是，它包含以下步骤：
[0012]1.设计并标记合成猪mtDNA Cytb基因特异性引物
[0013]根据GenBank猪mtDNA Cytb基因编码序列,经过DNAStar7.0软件比对后，采用Premier5.0 软件设计猪肉特异性引物，再利用NCBI中的在线软件Primer
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BLAST对设计的引物进行评估。送至上海生物工程股份有限公司标记合成。扩增产物为121bp，用TE缓冲液配制成12.5μM 的工作液，引物序列如下：
[0014]上游引物：5
’
(FAM)
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ATGCTTAGAAGGGATGA
‑3’
[0015]下游引物：5
’
(Biotin)
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TAGGGAGGCTATTACG
‑3’
[0016]2.基因组DNA的提取：
[0017]取待测样品0.1g置1.5ml离心管本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PCR
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免疫胶体金试纸条猪肉快速鉴定方法，其特征在于，它包含以下步骤：(1)设计并标记合成猪mtDNA Cytb基因特异性引物，引物序列如下(扩增长度为121bp)：上游引物：5
’
(FAM)
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GCCTAAATCTCCCCTCAATGC
‑3’
下游引物：5
’
(Biotin)
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ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTC
‑3’
(2)基因组DNA的提取：取待测样品0.1g置1.5ml离心管中剪碎，加入细胞裂解液500μl，充分混匀，在55℃水浴保温1小时；加到DNA纯化柱中，10000rpm/min离心3min；弃去过滤液，加入漂洗液600μl，10000rpm/min离心1min；弃去过滤液，重复1次；弃去过滤液，再离心2min，将DNA纯化柱转移入另一1.5ml离心管中，加入洗脱液100μl，室温放置5
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10min后，10000rpm/min离心2min；离心管中即为模板DNA溶液，作为供试品
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20℃冰箱中备用。(DNA提取试剂及各种溶剂均为提取0.1g样本时的加入量，根据实际样本量按比例调整)(3)PCR反应体系及反应程序：鉴定反应体系：PCR鉴定反应液23μl中加入供试品DNA溶液2μl；阳性对照反应体系：PCR鉴定反应液23μl中加入阳性对照DNA溶液2μl；空白对照反应体系：PCR鉴定反应液23μl中加入空白对照液2μl；将总体积为25μl的PCR反应管置于PCR反应仪中，按下列程序进行：94℃预变性5min，(94℃30s，56℃30s，72℃30s)，20个循环，72℃延伸10min。(4)免疫胶体金试纸条快速检测PCR产物取PCR产物取5μl滴加到免疫胶体金试纸条(市场有售，可购买)的样品区，然后插入到含有95μl展开缓冲液(与试纸条一起购买)的试管中，2
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【专利技术属性】
技术研发人员：王艳双，孙丽媛，高丽君，苑广信，李明成，王雪松，
申请(专利权)人：北华大学，
类型：发明
国别省市：