用于防治植物病害的假单胞菌属菌株及其代谢物制造技术

本公开内容涉及使用，可以抑制多种作物的多种微生物物种生长的，新的细菌菌株0617

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于防治植物病害的假单胞菌属菌株及其代谢物
专利

[0001]本专利技术属于生物农药领域。特别地，本专利技术涉及可以抑制多种微生物物种生长的七种新的假单胞菌属物种(Pseudomonas spp)菌株，0617
‑
T307、0917
‑
T305、0917
‑
T306、0917
‑
T307、0118
‑
T319、0318
‑
T327和0418
‑
T328，由该细菌菌株产生的细胞肉汤和新代谢物。假单胞菌属菌株0617
‑
T307、0917
‑
T305、0917
‑
T306、0917
‑
T307、0118
‑
T319、0318
‑
T327和0418
‑
T328已经保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并且分别具有ATCC登录号PTA
‑
126796、PTA
‑
126797、PTA
‑
126798、PTA
‑
126799、PTA
‑
126800、PTA
‑
126801和PTA
‑
126802。
[0002]专利技术背景
[0003]由病原微生物引起的植物病害呈指数增长且成本高昂。植物病原生物包括真菌、细菌、支原体、病毒、类病毒、线虫或寄生开花植物。目前，存在14种由细菌生物引起的常见植物病害，包括细菌性斑点病、细菌性光点病(bacterial light)和细菌性枯萎病等。火疫病(解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、柑桔溃疡病(地毯草黄单胞菌柑桔致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.citri)(Xac)]、细菌性叶斑病(BLS)[野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种(Xanthomonas campestris pv.vesicatora(XV
‑
16)]、橄榄节疤病萨氏假单胞菌萨氏致病变种(Pseudomonas Savastanoi pv.Savastanoi)(Psv)]和软腐病(甘薯软腐菌(Dickeya dadantii)、土豆果胶杆菌(Pectobacterium parmentieri)、黑腐果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum)和胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum))是毁灭性植物病害。在全国内，防治火疫病的成本估计超过1亿美元(Norelli等人(2003))。对于柑桔溃疡病，仅在佛罗里达州，从1995年至2005年实施根除计划的成本加上对商业种植者和房主的损害的住宅柑桔的补偿接近10亿美元。
[0004]火疫病是一种仁果的毁灭性病害，其由革兰氏阴性菌解淀粉欧文氏菌的感染引起，其在世界许多地方如欧洲、德国、奥地利和瑞士影响梨和苹果(Chen等人(2009))。虽然火疫病很少杀死整个果园，但是该病害及其防治仍然引起显著的经济损失。在太平洋西北和北加州，自1991年以来每年都有小爆发(minor outbreaks)，其中至少一些地区每3至4年经历大爆发。甚至小病害爆发可能是昂贵的，因为修剪以去除受感染的植物部分导致树木受损，降低了未来生产力。例如，4年的苹果果园中根茎枯萎病的10％发病率可以导致每英亩高达3500美元的损失(Norelli等人(2003))。
[0005]微生物天然产物已提供了大量的生物化合物作为农药(Gwinn(2018))。然而，目前用于细菌性植物病害的预防方法的效果有限。当感染风险高时，抗生素硫酸链霉素(FireWall,AgroSource,Inc.)和盐酸土霉素(FireLine,AgroSource,Inc.)已经是用于对抗解淀粉欧文氏菌的主要产品。因为这些化合物也用于管理人和动物的健康，因此在作物农业中使用这些相同的抗生素可能是有争议的(Stockwell(2012))。对于硫酸链霉素，关于抗生素抗性的问题已限制了其使用(Vrancken等人(2013))。正在研究的针对火疫病的另一种抗生素是春雷霉素。一个缺点是春雷霉素的频繁剂量导致破坏植物的植物毒性作用(Adaskaveg等人(2010))。另一个缺点是与其它抗生素相比，春雷霉素的成本高。因此，春雷霉素需要配有各种其它抗生素。
[0006]在最近几十年中，已经开发了许多非抗生素产品，这些产品已经向环境保护局(EPA)登记，得到国家有机计划(National Organic Program,NOP)批准，并且销售给果树栽培者以防治火疫病(Tianna等人(2018))。历史上，在欧洲已经注册了基于枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)的两种产品用于火疫病防治：基于菌株QST 713的和基于菌株BD 170的(Broggini等人(2005))。基于孢子形成杆菌的生物制剂由于其持久的生存力而为生物防治提供了优势(Haas等人(2005))。在USA和德国的许多田间试验中已经证实了两种基于芽孢杆菌的生物制剂的适度成功(Aldwinckle等人(2002)；Kunz等人(2011)；Laux等人(2003))。这表明杆菌属在防治解淀粉欧文氏菌的花感染中的可能潜力。然而，芽孢杆菌属仅在低感染压力下起作用。其在中度和高度感染压力情况下无效。关于两种生物产品，得到的结果是不稳定的，在71％和0％病害抑制之间变化(Broggini等人(2005))。
[0007]预期的生物保护产品在一方面必须与解淀粉欧文氏菌有效竞争，且在另一方面必须能够定殖于靶植物的不同器官上的相同小环境(niches)。保护性细菌产生影响病原体且竞争食物和空间的次级代谢产物，从而防止解淀粉欧文氏菌与植物相关的发病机理。在此情况下，来自假单胞菌属的细菌适合上述的生物保护因子(Haas等人(2005))。对于各种植物的定殖细菌的物种组成的分析显示假单胞菌属的荧光细菌的广泛存在。
[0008]在法国，发现假单胞菌属物种是栖息在健康和患病苹果树、梨和山楂的群体的主要组分，并且其中许多细菌显示限制解淀粉欧文氏菌在体外生长的能力(Paulin等人(1978))。然而，几乎没有报道有效代谢物的信息。
[0009]在加州，Thomson等人(1976)选择了三种对梨花朵保护有效的荧光假单胞菌(Thomson等人(1976))。在20世纪80年代中期，从加州梨树叶中分离的荧光假单胞菌(P.fluorescens)菌株A506显示限制解淀粉欧文氏菌生长的独特活性以及针对火疫病保护苹果和梨的保护能力(Lindow等人(1996))。已经开发了含有荧光假单胞菌的产品A506，自1996年以来市售可得。在加州、俄勒冈州和华盛顿州进行的许多实验证实了该制备物在各种苹果和梨保护计划中有用(Johnson(2000))。
[0010]在英国，使用荧光假单胞菌的两种分离株保护山楂的花和幼苗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种培养细菌以增强保护性代谢物的产生的方法，其包括：i.使假单胞菌属细菌在容器中的液体培养基中生长以产生细菌发酵物，其中培养基体积与容器体积的比例在约1:2至1:10之间，并且其中以在约100至250RPM之间的速率振荡容器，或ii.使假单胞菌属细菌在发酵罐中的液体培养基中生长以产生细菌发酵物，其中发酵罐的空气流速在约1至3L/min之间。2.权利要求1的方法，进一步包括在一段时间之后，将液体培养基与细菌分离以产生包含保护性代谢物的保护性上清液。3.权利要求1或2的方法，其中细菌选自由以下组成的组：土壤假单胞菌0617
‑
T307(登录号PTA
‑
126796)、土壤假单胞菌0917
‑
T305(登录号PTA
‑
126797)、土壤假单胞菌0917
‑
T306(登录号PTA
‑
126798)、土壤假单胞菌0917
‑
T307(登录号PTA
‑
126799)、摩氏假单胞菌0118
‑
T319(登录号PTA
‑
126800)、摩氏假单胞菌0318
‑
T327(登录号PTA
‑
126801)和摩氏假单胞菌0418
‑
T328(登录号PTA
‑
126802)。4.权利要求1
‑
3中任一项的方法，其中生长温度在约10℃至35℃之间。5.权利要求1
‑
4中任一项的方法，其中液体培养基是用于产生细胞的LB培养基。6.权利要求1
‑
4中任一项的方法，其中液体培养基是用于产生式(I)和式(II)的YME培养基：7.权利要求1
‑
6中任一项的方法，其可以使用振荡器或发酵罐进行。8.根据权利要求1
‑
6中任一项的方法，当使用振荡器时，其中培养基体积与容器体积的比例在约1:5至1:10之间。9.根据权利要求1
‑
6中任一项的方法，当使用振荡器时，其中培养基体积与容器体积的比例在约1:7至1:9之间。10.根据权利要求1
‑
6中任一项的方法，当使用振荡器时，其中培养基体积与容器体积的比例为约1:8。11.权利要求1
‑
10中任一项的方法，其中容器以约200至250RPM之间的速率进行振荡。12.权利要求1
‑
10中任一项的方法，其中容器以约210至230RPM之间的速率进行振荡。13.权利要求1
‑
6中任一项的方法，当使用发酵罐时，其中发酵罐的空气流速在约1.5至2.5L/min之间，或氧浓度在5mg/L至12mg/L之间。14.权利要求1
‑
13中任一项的方法，其中生长温度在约10℃至20℃之间。15.权利要求1
‑
13中任一项的方法，其中生长温度在约15℃至17℃之间。16.权利要求1
‑
15中任一项的方法，其中使细菌生长18小时至7天的时间段。
17.权利要求1
‑
15中任一项的方法，其中使细菌生长至少7天的时间段。18.权利要求1
‑
15中任一项的方法，其中使细菌生长1天至2天的时间段。19.农业组合物，其包含通过权利要求1
‑
18中任一项的方法产生的细菌发酵物或保护性上清液。20.权利要求19的农业组合物，其中保护性上清液或其代谢物的制剂选自溶液(SL)、可溶性粉末(SP)、可溶性颗粒(SG)和微囊制剂。21.权利要求19的农业组合物，其中细菌发酵物或细胞的制剂选自悬浮浓缩物(SC)、可湿性粉末(WP)和水分散性颗粒(WG)。22.权利要求19的农业组合物，进一步包含佐剂。23.权利要求22的农业组合物，其中佐剂是表面活性剂。24.权利要求19的农业组合物，其中佐剂是选择的活性成分、水和极性溶剂。25.权利要求23的农业组合物，其中表面活性剂选自润湿剂和铺展剂。26.权利要求25的农业组合物，其中表面活性剂是包含烷基聚氧化乙烯或聚氧化丙烯的润湿剂。27.一种防治细菌性作物病害的方法，包括步骤：i.产生农业组合物，其包含通过权利要求1
‑
18中任一项产生的细菌发酵物或保护性上清液或者权利要求19
‑
27中任一项的农业组合物；和ii.向作物施用所述农业组合物以抑制病原微生物的生长。28.权利要求27的方法，其中作物病害选自由以下组成的组：香蕉黑叶斑病、灰霉病、火疫病、柑桔溃疡病、软腐病、橄榄节疤病、番茄细菌性斑块病、细菌性溃疡病或瘟病(核果和仁果)、葫芦属的角斑病、桃的细菌性斑点病、番茄细菌性斑点病、核桃疫病、细菌性枯萎病、番茄溃疡病、马铃薯晚疫病、苹果黑星病、细菌性叶枯病和细菌性叶条斑病。29.权利要求27或28的方法，其中病原微生物选自由以下组成的组：斐济球腔菌、灰葡萄孢、解淀粉欧文氏菌(Ea)(特别是链霉素抗性解淀粉欧文氏菌菌株)、地毯草黄单胞菌柑桔致病变种(Xac)、土豆果胶杆菌、黑腐果胶杆菌、胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种、胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种、甘薯软腐菌、萨氏假单胞菌萨氏致病变种(Psv)、丁香假单胞菌番茄致病变种、丁香假单胞菌丁香致病变种、丁香假单胞菌黄瓜致病变种、野油菜黄单胞菌桃穿孔致病变种、野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种、居树黄单胞菌核桃致病变种、青枯雷尔氏菌、密执安棍状杆菌密执安亚种、致病疫霉、苹果黑星菌、水稻黄单孢菌水稻致病变种、水稻黄单孢菌条斑致病变种和柑桔黄单胞菌柑桔致病变种。30.根据权利要求27
‑
29中任一项的方法，其中作物选自由以下组成的组：香蕉，苹果，梨，海棠，柑桔，马铃薯，南瓜，洋葱，稻，非洲紫罗兰，十字花科、茄科、葫芦科的植物物种包括胡萝卜、马铃薯、番茄、茄子、绿叶蔬菜、倭瓜和葫芦，胡椒和青椒，橄榄，核果和仁果植物包括橄榄、桃、核桃。31.一种防治鱼病害的方法，其中病原微生物为柱状黄杆菌#_2、柱状黄杆菌MS
‑
FC
‑
4、饲料添加剂、水族箱消毒剂、具有任何形式、构造或结构的细菌固定材料(例如富含所述菌株的园艺用块体)。32.一种防治人病原细菌引起的病害的方法，其中细菌为大肠杆菌O157:H7。33.一种防治细菌性作物病害的方法，包括：
向作物施用包含在约1.0
×
105至1.0
×
109cfu每mL之间的假单胞菌属细菌的农业组合物以抑制病原微生物的生长。34.权利要求33的方法，其中假单胞菌属细菌选自由以下组成的组：土壤假单胞菌0617
‑
T307(登录号PTA
‑
126796)、土壤假单胞菌0917
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：杨庆鸿，刘向阳，
申请(专利权)人：UWM研究基金会有限公司，
类型：发明
国别省市：