用于检测神经母细胞瘤MYCN扩增的标志物及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种血浆游离DNA羟甲基化修饰的检测神经母细胞瘤MYCN扩增的标志物，该标志物为分离自外周血的具有羟甲基化修饰MYCN基因或其片段。本发明专利技术还提供了相应的试剂及试剂盒。以外周血为样品，通过数字PCR对具有羟甲基化修饰的MYCN基因或其片段进行检测，无需对神经母细胞瘤进行侵袭性采样，即可有效判断临床FISH检测MYCN扩增的结果，具有安全无创、样本易于获得、准确性高、操作方便等优点。操作方便等优点。操作方便等优点。

【技术实现步骤摘要】
用于检测神经母细胞瘤MYCN扩增的标志物及其用途


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种用于检测神经母细胞瘤MYCN扩增的标志物及其用途。

技术介绍

[0002]25％的儿童神经母细胞瘤患者的癌细胞中发现了MYCN的扩增，根据国际神经母细胞瘤风险组和儿童肿瘤组的风险分层，神经母细胞瘤中的MYCN基因扩增是最重要的风险评估指标之一。
[0003]关于神经母细胞瘤中的MYCN基因拷贝数的检测，目前最常用的是荧光原位杂交法(fluorescence in situ hybridization，FISH)，该方法已经应用于临床。然而，目前已知的标志物是位于神经母细胞瘤中的MYCN，其检测需要经过组织穿刺取样，由于获取石蜡或冷冻包埋组织的侵袭性取样要求，了解神经母细胞瘤中MYCN的扩增状态既费时费力而且会给儿童带来痛苦。此外，由于组织穿刺不充分，有时需要重复取样，这进一步增加了儿童的痛苦和家庭的经济负担。
[0004]本领域亟待开发新的易于取样、易于检测且准确性高的新型肿瘤标志物。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种基于血浆游离DNA羟甲基化修饰的肿瘤标志物，本专利技术提供的肿瘤标志物为存在于外周血的游离DNA的具有羟甲基化修饰的MYCN核苷酸片段。以外周血为样品，通过数字PCR对具有羟甲基化修饰的MYCN基因或其片段进行检测，可以有效判断临床FISH检测MYCN扩增的结果。从而无需对神经母细胞瘤进行侵袭性采样，即可用于鉴定神经母细胞瘤患者是否发生MYCN扩增以及对患神经母细胞瘤患者的治疗效果、预后评估等。
[0006]为此，第一方面，本专利技术提供一种分子标志物，所述分子标志物为分离自外周血的具有羟甲基化修饰的MYCN基因或其片段。
[0007]本专利技术的第二方面，提供一种分子标志物在制备神经母细胞瘤检测试剂或试剂盒中的用途，所述分子标志物为分离自受试者外周血中的具有羟甲基化修饰的MYCN基因或其片段。
[0008]进一步，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列的引物扩增所述分子标志物。
[0009]本专利技术的第三方面，提供一种试剂或组合的试剂，其特异性检测分子标志物的羟甲基化修饰情况，所述分子标志物为具有羟甲基化修饰的MYCN基因或其片段。
[0010]进一步，所述试剂或组合的试剂包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列的引物。
[0011]本专利技术的第四方面，提供一种基于分子标志物进行神经母细胞瘤检测的试剂盒，其包括试剂或组合的试剂；所述试剂或组合的试剂特异性检测所述分子标志物的羟甲基化修饰情况；所述分子标志物为具有羟甲基化修饰的MYCN基因或其片段。
[0012]进一步，所述试剂或组合的试剂包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列的引物。
[0013]本专利技术的第五方面，提供一种体外检测待测样品羟甲基化谱式的方法，所述方法用于非诊断目的，其包括：(1)取受试者外周血的游离DNA(cfDNA)作为待测样本；(2)建立所述待测样本的5hmC文库；(3)以所述5hmC文库为模板，通过数字PCR对靶序列的羟甲基化修饰情况进行检测；其中，所述靶序列为MYCN基因或其片段。
[0014]进一步，所述数字PCR的引物包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列的引物。
[0015]本专利技术的第六方面，提供一种诊断神经母细胞瘤患者MYCN扩增和/或预测神经母细胞瘤风险的系统，其包括游离DNA提取装置、游离DNA处理装置、测序装置、对比装置、结果判定装置
[0016]所述游离DNA提取装置用于从受试者的外周血样品中抽提游离DNA；
[0017]所述游离DNA处理装置与所述游离DNA提取装置相连，所述游离DNA处理装置用于将所述游离DNA进行末端补齐并与测序接头连接，得到DNA连接样品；
[0018]所述测序装置与所述游离DNA处理装置相连，所述测序装置基于所述DNA连接样品构建5hmC文库，并测序获得测序数据；
[0019]所述对比装置与所述测序装置相连，所述比对装置用于所述测序数据与参考序列进行比对，基于比对结果确定所述测序数据中分子标记物的羟甲基化修饰情况；
[0020]所述结果判定装置与所述比对装置相连，所述结果判定装置基于所述测序数据中分子标记物的羟甲基化修饰情况，判定所述受试者是否患有神经母细胞瘤或预测受试者患神经母细胞瘤的风险；其中，所述分子标记物为具有羟甲基化修饰的MYCN基因或其片段。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的技术方案具有以下优点：
[0022]本专利技术提供了一种基于血浆游离DNA羟甲基化分子标志物，可用于有效表征临床MYCN荧光杂交(FISH)检测的结果。通过以外周血为样品，通过数字PCR对具有羟甲基化修饰的MYCN基因或其片段进行特异性检测，可以有效判断临床FISH检测MYCN扩增的结果。从而无需对神经母细胞瘤进行侵袭性采样，即可用于鉴定受试者是否患有神经母细胞瘤、鉴定受试者罹处于患神经母细胞瘤风险、对患神经母细胞瘤患者的治疗效果评估等。具有安全无创、样本易于获得、准确性高、操作方便等优点，为临床MYCN检测提供更加便捷以及准确的判断。
附图说明
[0023]通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本专利技术的限制。在附图中：
[0024]图1：IGV可视化展示FISH检测MYCN阳性患者、FISH检测MYCN阴性患者以及健康儿童的外周血游离DNA中MYCN基因羟甲基化分布图；
[0025]图2：实施例3的数字PCR检测结果；其中，空白对照组5例、健康对照组22例、MYCN阳性组13例和MYCN阴性组35例。
具体实施方式
[0026]下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0027]在本专利技术的实施例中，采用5hmC
‑
Seal高通量测序法对样本进行测序，对以下实施例所采用的5hmC
‑
Seal高通量测序法解释如下：
[0028]5hmC
‑
Seal是一种基于5hmC的高通量测序方法。这种方法以改进后的化学糖基化标记为基础，结合二代高通量测序技术，得到5hmC在基因组DNA上的分布信息。
[0029]由于化学标记法的高度灵敏特性，输入的DNA可以低至1
‑
10ng，所述的DNA可以是打碎后的基因组DNA，也可以是cfDNA等小片段，按照二代测序的要求，在DNA片段两端进行补平，之后在3
’
端连接上一个A tail，借由本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分子标志物，其特征在于，所述分子标志物为分离自外周血的具有羟甲基化修饰的MYCN基因或其片段。2.权利要求1所述的分子标志物在制备神经母细胞瘤检测试剂或试剂盒中的用途。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列的引物扩增所述分子标志物。4.一种试剂或组合的试剂，其特征在于，所述试剂或组合的试剂特异性检测权利要求1所述的分子标志物的羟甲基化修饰情况。5.如权利要求4所述的试剂或组合的试剂，其特征在于，其包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列的引物。6.一种基于分子标志物进行神经母细胞瘤检测的试剂盒，其特征在于，包括试剂或组合的试剂；所述试剂或组合的试剂特异性检测权利要求1所述分子标志物的羟甲基化修饰情况。7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂或组合的试剂包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列的引物。8.一种体外检测待测样品羟甲基化谱式的方法，所述方法用于非诊断目的，其特征在于，包括：(1)取受试者外周血的游离DNA作为待测样本；(2)建立所述待测样本的5hmC文库；(3)以所述5hmC文库为模板，通过数字PCR对靶序列的羟甲基化...

【专利技术属性】
技术研发人员：林坚，陈航宇，陈龙，易湛苗，
申请(专利权)人：北京大学第三医院，
类型：发明
国别省市：