一种柞蚕蛹ACE抑制蛋白肽的制备方法技术

一种柞蚕蛹ACE抑制蛋白肽的制备方法，是以柞蚕蛹蛋白粉为原料加入pH为10.5的缓冲液制备成蛋白液，先采用碱性蛋白酶进行第一步水解，然后采用胃蛋白酶进行第二步水解。本发明专利技术采用柞蚕蛹为原料制备的ACE抑制蛋白肽在分离纯化后具有较小的分子量分布范围，ACE抑制率最高可达到79.42%，同时还具有较优异的抗氧化还原能力，ABTS自由基清除率为95.17%，DPPH自由基清除率为95.64%。由基清除率为95.64%。由基清除率为95.64%。

【技术实现步骤摘要】
一种柞蚕蛹ACE抑制蛋白肽的制备方法


[0001]本专利技术涉及蛋白肽制备
，具体涉及一种柞蚕蛹ACE抑制蛋白肽的制备方法。

技术介绍

[0002]我国是柞蚕产业大国，柞蚕资源的分布全国，多分布于东北，柞蚕茧年产量在9万t左右，产值40亿元左右。长期以来，我国的蚕蛹加工利用率低，除多数经烘干粉碎直接作为畜禽饲料和营养添加剂外，有些甚至被当做肥料或直接废弃，造成资源的巨大浪费。随着蚕丝工业的发展和蚕茧产量的不断增加，蚕蛹的综合利用和深层开发成为急需解决的问题。
[0003]柞蚕蛹蛋白质是一种完全蛋白，蛋白含量在50％以上，含有18种氨基酸，柞蚕蛹中常见的17种氨基酸占总氨基酸质量分数的34.57％。其中人体不能合成，必须由外界供给的必需氨基酸如蛋氨酸、赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸等在蚕蛹中含量均较高，总量达14.59％，占总氨基酸的42.20％，营养价值及其乐观，是多肽制备的优质原料之一。柞蚕蛹蛋白具有较高的营养和功能特性，但由于其分子结构复杂、分子量(MW)较大，人体不能有效吸收它，从而导致过敏效应。因此，蛋白质必须通过水解来产生低分子量的片段，以改善生物功能、溶解性和生物利用度。
[0004]高血压是近年来主要的心血管公共疾病之一，严重影响人体健康。高血压主要是由血管紧张素I转换酶(ACE,EC 3.4.15.1)浓度增高所致。血管紧张素I转换具有依赖锌的二肽基结构的酶(ACE,EC 3.4.15.1)羧肽酶不仅能促进血管收缩八肽的生成，也有非活性缓激肽。目前，许多人造化学品都有很好的ACE抑制剂能力，如卡托普利、依那普利和赖诺普利。然而，这些药物有明显的负面影响，通常会引起干咳，血管性水肿，味觉紊乱和皮疹。因此，寻找无毒的ACE抑制剂天然来源已成为治疗高血压的有效途径。蚕蛹蛋白水解物(SPP水解物)对ACE有抑制作用。Meng et al.(2016)从蚕蛹蛋白中发现一种新的ACE抑制肽，是用中性蛋白酶水解蚕蛹蛋白，获得的蚕蛹肽为分子量大小为603.7Da。
[0005]多肽的制备主要通过酶法、发酵法等食品生物技术手段从天然动植物蛋白质中得到，具有抗氧化活性稳定、无毒副作用及来源方便等优点。酶水解中最重要的因素是酶的种类选择、酶的浓度、温度、时间、pH和底物浓度，为了获得理想的水解产物，优化酶解工艺参数也是必不可少的。酸水解和碱水解是伴随致癌物质形成的剧烈反应，而酶水解是一种温和的反应，一直是从蛋白质中生产活性肽的主要过程。开发具有保健作用的生物活性肽已成为21世纪生物化学工业的一个活跃研究领域。
[0006]采用酶水解能获得有生物活性的多肽，但是均是盲目酶解蛋白，水解产物的效果不稳定，鉴于此，我们开发了一种具有更好的抗氧化活性和降血压活性的柞蚕蛹蛋白肽。

技术实现思路

[0007]本专利技术目的在于提供一种柞蚕蛹ACE抑制蛋白肽的制备方法。
[0008]本专利技术目的通过如下技术方案实现：
[0009]一种柞蚕蛹ACE抑制蛋白肽的制备方法，其特征在于：以柞蚕蛹蛋白粉为原料加入pH为10.5的缓冲液制备成蛋白液，先采用碱性蛋白酶进行第一步水解，然后采用胃蛋白酶进行第二步水解。
[0010]进一步，第一步酶解中蛋白液浓度为3.5wt.％，添加酶活为250U/mg的的碱性蛋白酶，添加浓度为6.5wt.％，水解温度为50℃，添加超纯水后进行恒温水解4h。
[0011]进一步，第二步水解是将第一步水解后的酶解液pH调节至1.5
‑
3.5，添加酶活为30U/mg的胃蛋白酶，添加浓度为1
‑
3.5wt.％，在35
‑
42℃下水解10
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20min。
[0012]优选的，胃蛋白酶的添加浓度为3wt.％，水解温度为37℃，水解时间为15min。
[0013]优选的，在第二步水解之前，在第一步水解得到的酶解液中加入硫酸钠，添加浓度为0.4
‑
0.8wt.％加热至40
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50℃，保温30
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60min。
[0014]不同的蛋白酶有着不同的特定的水解位点，作用于同一蛋白质底物是可以得到不同的肽产物，因此对于蛋白酶的选择尤其重要。先采用高浓度碱性蛋白酶在较长时间的水解，使得柞蚕蛹蛋白质水解较为完全。在第一步水解后添加了少量的硫酸钠，调节了水解产物的溶解度，再经胃蛋白酶水解时，发现水解的肽的C末端和N末端的氨基酸在排列形成了较高的生物活性。采用胃蛋白酶在极短时间内进行二次水解，在极短的水解时间有效保存了碱性蛋白酶已经完全水解形成的肽链的整体结构，同时有效的减小了肽的分子量大小以及分子量的分布范围。
[0015]具体的，一种柞蚕蛹ACE抑制蛋白肽的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
[0016](1)以柞蚕蛹蛋白粉为原料加入pH为10.5的缓冲液制备成浓度为3.5wt.％的蛋白液，添加酶活为250U/mg的碱性蛋白酶，使其浓度达到6.5wt.％，水解温度为50℃，进行第一步水解，水解时间为4h；
[0017](2)将步骤(1)水解后的酶解液pH调节至1.5
‑
3.5，添加酶活为30U/mg的胃蛋白酶，添加浓度为1
‑
3.5wt.％，在35
‑
42℃下进行第二步水解，水解时间为10
‑
20min；
[0018](3)将水解后的酶解液在1000rpm下离心15min，取上清液，使用3kDa的滤膜进行超滤，得到分子量小于3kDa的柞蚕蛹蛋白肽溶液，然后进行干冻得到蚕蛹ACE抑制肽粉。
[0019]优选的，一种柞蚕蛹ACE抑制蛋白肽的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
[0020](1)以柞蚕蛹蛋白粉为原料加入pH为10.5的缓冲液制备成浓度为3.5wt.％的蛋白液，添加酶活为250U/mg的碱性蛋白酶，使其浓度达到6.5wt.％，水解温度为50℃，进行第一步水解，水解时间为4h；
[0021](2)在第一步水解得到的酶解液中加入硫酸钠，添加浓度为0.4
‑
0.8wt.％加热至40
‑
50℃，保温30
‑
60min；
[0022](3)将步骤(2)处理后的酶解液pH调节至1.5
‑
3.5，添加酶活为30U/mg的胃蛋白酶，添加浓度为1
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3.5wt.％，在35
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42℃下进行第二步水解，水解时间为10
‑
20min；
[0023](4)将水解后的酶解液在1000rpm下离心15min，取上清液，使用3kDa的滤膜进行超滤，得到分子量小于3kDa的柞蚕蛹蛋白肽溶液，然后进行干冻得到蚕蛹ACE抑制肽粉。
[0024]本专利技术具有如下技术效果：
[0025]本专利技术采用柞蚕蛹为原料制备的ACE抑制蛋白肽在分离纯化后具有较小的分子量分布范围，ACE抑制率最高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种柞蚕蛹ACE抑制蛋白肽的制备方法，其特征在于：以柞蚕蛹蛋白粉为原料加入pH为10.5的缓冲液制备成蛋白液，先采用碱性蛋白酶进行第一步水解，然后采用胃蛋白酶进行第二步水解。2.如权利要求1所述的一种柞蚕蛹ACE抑制蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述第一步酶解中蛋白液浓度为3.5wt.%，添加酶活为50U/mg的碱性蛋白酶，添加浓度为6.5wt.%，水解温度为50℃，添加超纯水后进行恒温水解4h。3.如权利要求1所述的一种柞蚕蛹ACE抑制蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述第二步水解是将第一步水解后的酶解液pH调节至1.5
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3.5，添加酶活为30U/mg的胃蛋白酶，添加浓度为1
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3.5wt.%，在35
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42℃下水解10
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20min。4.如权利要求1所述的一种柞蚕蛹ACE抑制蛋白肽的制备方法，其特征在于：在第二步水解之前，在第一步水解得到的酶解液中加入硫酸钠，添加浓度为0.4...

【专利技术属性】
技术研发人员：王刚，赵艺芯，郭明珠，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：