一种免疫印迹膜再生液及其使用方法技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种免疫印迹膜再生液及其使用方法。所述免疫印迹膜再生液包括柠檬酸。本发明专利技术所提供印迹膜再生液，不仅可以快速高效剥离膜上结合的一抗二抗及辣根过氧化物酶复合物，而且可以重新利用使用过的蛋白印迹膜检测其他目的蛋白，从而达到良好的再次重复使用印迹膜的目的。本发明专利技术所提供的方法省时省力，避免了重复配胶，跑胶，蛋白上样等操作带来的人为误差，使数据可比性，准确性大大提高。另外，通过本方法可以重复洗脱NC膜多达3次，而且使用0.01M本试剂95℃左右只需大概10min就可以实现蛋白印迹膜的重复使用，在很大程度上节约了常规蛋白质免疫印迹的相关费用。相关费用。相关费用。

【技术实现步骤摘要】
一种免疫印迹膜再生液及其使用方法


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种免疫印迹膜再生液及其使用方法。

技术介绍

[0002]Western blotting又称免疫印迹及蛋白质印迹（immunoblotting），是一种用于检测、表征和定量蛋白质的技术。该过程首先涉及在聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离蛋白质混合物，包括靶蛋白。并将分离后的蛋白质转移或吸附到硝化纤维素或PVDF膜上，以固定蛋白质。然后，使用合适的抗体，通过简单的抗原
‑
抗体反应来检测靶蛋白。使用一级抗体结合特异性靶蛋白，然后使用二级抗体检测抗原
‑
抗体复合物。靶蛋白显示为膜上的谱带。蛋白印迹法可应用于诊断、生物技术、分子生物学、蛋白质组学等，且在评估细胞中的蛋白表达水平以及大小和其他属性的变化时均广泛依赖于这种方法。
[0003]在免疫印迹检测过程中，除了检测目的蛋白，还要检测内参蛋白，像tubulin, actin及GAPDH等。但是常规的、电转移蛋白质后的印迹膜只能做一次免疫印迹检测，无法在同一张膜上再次对内参蛋白进行检测；如果要对内参蛋白进行检测，只能再次进行另一个流程的免疫印迹操作，结果会导致数据误差偏大，误导科研人员。虽然目前已经报道了多种基于灭活HRP活性的stripping buffer（中文翻译为：洗脱液；再生液；去除液）可使印迹膜再生重复使用,包括 H2O2，叠氮化钠，3,3
‑
二氨基联苯胺或 Vector SG和乙酸，但这些方法有其自身的局限性。
专利技术内容
[0004]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种免疫印迹膜再生液及其使用方法。
[0005]本专利技术所采取的技术方案如下：一种免疫印迹膜再生液，其包括柠檬酸。
[0006]其为0.01 M
‑
0.02M的柠檬酸，溶剂为ddH2O，pH值6.0~7.0。
[0007]如上所述的免疫印迹膜再生液的使用方法，其包括以下步骤：（1）将蛋白质免疫印迹膜用ddH2O漂洗；（2）将步骤（1）漂洗后的蛋白质免疫印迹膜转移到如上所述的免疫印迹膜再生液中，升温至90
‑
100℃并于90
‑
100℃处理；（3）将步骤（2）处理后的蛋白质免疫印迹膜用ddH2O漂洗并浸润在双蒸水中，直至检测前取出并加入酶底物进行检测。
[0008]蛋白质免疫印迹膜通过如上所述的免疫印迹膜再生液进行重复剥膜且重复剥膜次数不超过3次。
[0009]本专利技术的有益效果如下：本专利技术所提供印迹膜再生液，不仅可以快速高效剥离膜上结合的一抗二抗及辣根过氧化物酶复合物，而且可以重新利用使用过的蛋白印迹膜以检测其他目的蛋白，从而达到良好的再次重复使用印迹膜的目的。本专利技术所提供的方法省时省力，避免了重复配胶，跑胶，蛋白上样等操作带来的人为误差，使数据可比性，准确性大大
提高。另外，通过本方法可以重复洗脱NC膜多达3次，而且使用0.01M本试剂95℃左右只需大概10min就可以实现蛋白印迹膜的重复使用，在很大程度上节约了常规蛋白质免疫印迹的相关费用。
附图说明
[0010]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本专利技术的范畴。
[0011]图1为使用斑点印记方法进行检测的结果；A、B、C、D分别为不同去除液去除条件进行去除前后的对比；图2为vinculin及p
‑
JNK蛋白western blot 显影后(图2.A; 图2.B)，0.01M再生液10min处理后再次孵育的结果(图2.C; 图2.D);图3为通过正常western blot操作(图3.A; 图3.B)与再生液处理组(电转移完毕后，印迹膜进行0.01M再生液的10min处理) (图3.C; 图3.D)对比；图4为将电转移蛋白vinculin (图4.A1)的NC膜进行洗脱5次(印迹膜进行0.01M再生液的10min处理; 图4.A2; 图4.A4；图4.A6；图4.A8；图4.A10)，每次剥膜后再进行新的不同类抗原检测，分别是Atg7，UBA5, JNK, ERK1/2 (图4.A3; 图4.A5；图4.A7；图4.A9)的结果。
具体实施方式
[0012]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作进一步地详细描述。
[0013]1.实验材料和方法（1）实验材料柠檬酸(分子量：192.12；货号：C8610索莱宝，中国)0.45μm 孔径的 NC 膜 (Millipore, Massachusetts, United States)BeyoECL Star 化学发光底物；Bradford 蛋白检测试剂盒；RIPA 缓冲液(碧云天生物技术，Shanghai，China) ；3色蛋白负载标记(TOROIVD，Shanghai，China)；4周龄23克成年雄性 C57BL/6J 小鼠，Gem Pharma tech Co. ，Ltd (许可生产号码: SCXK
‑
(SU)
ꢀ‑
2018
‑
0008; 中国南京)；本研究获得温州医科大学医学伦理委员会伦理学批准。所有实验程序均经温州医科大学动物护理与使用委员会认可(编号:2021
‑
0020)，将小鼠维持在摄氏24
‑
25度，昼夜循环(12/12小时) ，并提供水和食物。
[0014]表1.材料及来源
抗体来源编号分子量稀释度RabbitSAPK/JNKCellSignalingTechnology9252S46,54KDa1:1,000Rabbit Phospho
‑
SAPK/JNK(Thr183/Tyr185)CellSignalingTechnology#466846,54KDa1:1,000
RabbitAnti
‑
Vinculinabcamab129002[EPR8185]124KDa1:1,0000RabbitAnti
‑
Uba5AntibodyAffinityBiosciencesAF922045KDa1:1,000RabbitmAbanti
‑
Atg7CellSignalingTechnologyD12B1178kDa1:1,000ERK1/2antibodyCellSignalingTechnology137F544,42kDa1:1,000HRP偶联的山羊抗鼠IgGJacksonimmumoResearch132670 1:5,000HRP偶联的山羊抗兔IgGJacksonimmumoResearch134094 1:8,000
（2）实验方法：配制再本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种免疫印迹膜再生液，其特征在于：其包括柠檬酸。2. 根据权利要求1所述的免疫印迹膜再生液，其特征在于：其为0.01 M
‑
0.02M的柠檬酸，溶剂为ddH2O，pH值6.0~7.0。3.如权利要求1或2所述的免疫印迹膜再生液的使用方法，其特征在于包括以下步骤：（1）将蛋白质免疫印迹膜用ddH2O漂洗；（2）将步骤（1）漂洗后的蛋白质免疫印迹膜转移到如权利要求1或2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：许朝进，任艳华，许泽婷，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：