本发明专利技术提供了一种鼻咽癌相关基因ＥＢＮＡ１的早期检测试剂盒，包括鼻咽癌相关基因ＥＢＮＡ１扩增用基因特异性引物、ｄＮＴＰ、用于ＰＣＲ反应的ＤＮＡ聚合酶及其缓冲液。本发明专利技术还提供了鼻咽癌相关基因ＥＢＮＡ１的早期检测方法及其应用。本发明专利技术的检测试剂盒和检测方法操作简单、试剂稳定、重复性好、特异性和敏感性均较高，ＰＣＲ检测可以批量进行，对于大规模的鼻咽癌筛查是一种有价值的指标，具有广阔的市场前景，在鼻咽癌高危人群的筛查以及鼻咽癌的早期发现和早期诊断中具有重要的临床价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及鼻咽癌早期检测试剂盒和检测方法，特别是一种鼻咽癌相关基 因EBNAl的早期检测试剂盒及其检测方法和应用。
技术介绍
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是中国南方和东南亚地区的常见 恶性肺瘤，其发病率在15-50/10万人口。鼻咽癌的发生有多种遗传和环境因素 的参与，其中Epstein-Barr病毒(EB病毒)作为一种特殊的环境致病因子，与 鼻咽癌高度相关鼻咽癌患者血清中EB病毒特异性抗体水平显著升高；EB病 毒的感染发生于鼻咽癌细胞单克隆增殖之前；EB病毒DNA及其表达产物在鼻 咽癌病灶中的广泛检出等，均提示EB病毒在鼻咽癌的发生发展中起着重要作 用。但是EB病毒的感染在大多数人群中并不引起疾病。因此，在鼻咽癌细胞中 可能存在具有转化能力的致癌性EB病毒亚;f朱。EBNAl ( Epstein-Barr nuclear antigen 1， EBNAl )是唯一在EB病毒相关肿 瘤细胞中均有表达的蛋白，在病毒的潜伏性感染中有重要的功能。EBNAl可以 激活EB病毒的DNA复制，在宿主细胞的分裂过程中，EBNAl蛋白可与细胞分 裂中期染色体相结合，介导EB病毒游离体在子代细胞的平均分配。作为转录激 活子，EBNAl可以促进其他EBNA蛋白，以及LMP1蛋白的表达。EBNAl可 以分为P-ala， P-thr， V-val， V-leu和V-pro五种亚型。在广东地区患者的鼻咽癌 组织中，全部为单一的V-val突变型，提示这种突变型与鼻咽癌有密切的相关性。 目前还没有一种将EBNAl基因的检测用于诊断鼻咽癌中。
技术实现思路
为克服上述技术缺陷，本专利技术的目的之一是提供一种鼻咽癌相关基因EBNA1 的早期检测试剂盒。本专利技术的鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测试剂盒，包括鼻咽癌相关基因 EBNA1扩增用基因特异性引物、dNTP、用于PCR反应的DNA聚合酶及其緩冲液。优选的，所述EBNAI扩增用基因特异性引物如下 5'-cgggagcgatagagcagggc-3'， 5'-ggggagacgactcaatggtgt-3'。优选的，本专利技术的鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测试剂盒还包括阳性对 照，所述阳性对照为B95-8细胞DNA。优选的，本专利技术的鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测试剂盒还包括阴性对 照，所述阴性对照为BJAB细胞DNA。本专利技术的第二个目的是提供鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测方法。将待 检模板DNA通过EBNA1扩增用基因特异性引物进行PCR扩增。所述EBNA1 扩增用基因特异性引物如下5' -cgggagcgatagagcagggc-3'，5'陽ggggagacgactcaatggtgt-3'。本专利技术的第三个目的是提供了鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测试剂盒 在早期诊断鼻咽癌中的应用。同现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果本专利技术公开了一种鼻咽癌诊断试剂盒及其检测方法与应用，该试剂盒可以 快速、准确地进行外周血EB病毒EBNA1亚型的检测，从而可以对鼻咽癌做出 快速的辅助诊断，具有重要的临床应用价值。作为一种无创伤性而快速的检查 方法，在鼻咽癌高危人群的筛查以及鼻咽癌的早期发现和早期诊断中具有重要 的临床价值。本专利技术的检测试剂盒和检测方法操作简单、试剂稳定、重复性好、 特异性和敏感性均较高，PCR检测可以批量进行，对于大规模的鼻咽癌筛查是 一种有价值的指标，具有广阔的市场前景。通过检测鼻咽癌患者和EB病毒携带者外周血中EBNA1的亚型，进行统计学分析，根据EBNA1亚型与鼻咽癌的相 关性，可为鼻咽癌的临床早期诊断找到新的生物标记物。具体实施方式为使本专利技术更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应 理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。 病例选择及试验方法我们的随机外周血样品包括144份携带有EB病毒的健康成人外周血样品和 36例鼻咽癌患者外周血标本。所有病例和对照个体均为广东地区居民操白话方 言者。144例健康人中男性79例，女性65例，平均年龄为41.62岁(年龄范围 20 ~ 82岁)。36例鼻咽癌患者均经CT和病理确i貪，其中男性26例，女性10例， 平均年龄为48.4岁(年龄范围29~74岁)。其中临床分期为I期者1例，II期 6例，m期12例，W期17例。病理诊断为未分化型非角化鳞状细胞癌者32例， 分化型非角化鳞状细胞癌者4例。用2ml EDTA采血管进行^iL,通过淋巴细胞分离液分离获得外周血单个核 细胞。采用QIAamp DNA mini blood kit (购自德国QIAGEN公司)抽提外周血 细胞DNA，操作方法按试剂盒说明书进行。为鉴定EBNAl基因的亚型，在其 C末端第487位氨基酸两端设计一对引物,正义引物为5'-cgggagcgatagagcagggc-3' (109,241-109,260 nt )，反义引物为5'-ggggagacgactcaatggtgt-3' (109，549-109，569 nt)。 PCR产物长329bp,在ABIPRISM377DNA测序仪上进行测序。 EBNA1检测试剂盒组成1、 PCR试剂包括PCR緩沖液，dNTP, Taq DNA聚合酶，均购自大连宝 生物工程有限公司。EBNA1引物5'陽cgggagcgatagagcagggc陽3,， 5'誦ggggagacgactcaatggtgt-3'。2、 阳性对照为B95-8细胞DNA(含有原型EBNA1基因)，阴性对照为BJAB 细胞DNA (不含EB病毒基因组)。1、全血的分离从患者体内抽取EDTA抗凝血2ml，用淋巴细胞分离液进 行分离，在水平离心机离心3000rpm， 30分钟，4°C,吸取单个核细胞层，用 磷酸盐緩冲液(PBS， pH7.4)洗一次，再加入200nlPBS,混匀，获得外周 血单个核细胞悬浮液，使用前可置于-20。C保存。2、抽提DNA:细胞悬液解冻后，用QIAamp DNA mini blood kit抽提 DNA，操作方法按试剂盒说明书进行先加入1/10体积的蛋白酶K溶液，充 分混匀后再加入等体积的消化緩冲液，在56°C恒温水浴箱中孵育2小时； 95。C， 15分钟，灭活蛋白酶K;加入等体积的无水乙醇，把混合溶液加入 QIAamp DNA分离柱中，室温下离心14000rpm , 1分钟；换新的离心管，加 入AWl溶液500ul，室温下离心8000rpm， 1分钟；换新的离心管，加入AW2 溶液500ul,室温下离心14000rpm， 3分钟；换新的离心管，室温下离心 14000rpm, 1分钟；换新的离心管，加入灭菌纯水50ul，室温下》文置10分钟； 室温下离心8000rpm, 1分钟，得到DNA溶液；在紫外分光光度计上测光密 度。抽提好的DNA使用前可置于-20°C保存。3 、 PCR反应在PCR管中加入PCR buffer ( 10x ) 2.5|al， dNTP ( 2.5mM) 2ul， EBNA1引物(50(^M)各0.5pl， Taq polymerase ( 5U/nl) 0.3pl，模板DNA 0.5pg,加灭菌纯水使总反应体积达25!al，置于P本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鼻咽癌相关基因ＥＢＮＡ１的早期检测试剂盒，其特征在于，包括鼻咽癌相关基因ＥＢＮＡ１扩增用基因特异性引物、ｄＮＴＰ、用于ＰＣＲ反应的ＤＮＡ聚合酶及其缓冲液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：买世娟，谢丹，孔祥复，黄宇帆，廖奕佶，邓海霞，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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