一组快速检测苹果炭疽叶枯病菌对QoI类杀菌剂抗性的引物组合物及检测方法和应用技术

本发明专利技术涉及一组快速检测苹果炭疽叶枯病菌对QoI类杀菌剂抗性的引物组合物及检测方法和应用，属于生物技术领域。所述引物组合物由正向内引物FIP，核苷酸序列如SEQ ID NO.1；反向内引物BIP，核苷酸序列如SEQ ID NO.2；正向外引物F3，核苷酸序列如SEQ ID NO.3和反向外引物B3，核苷酸序列如SEQ ID NO.4组成。本发明专利技术的检测方法简便易行、灵敏度高、特异性强，为苹果炭疽叶枯病菌对QoI类杀菌剂抗性的检测提供了新的技术手段。本发明专利技术对苹果炭疽叶枯病的抗性治理和减少化学农药使用具有重要的现实意义。义。义。

【技术实现步骤摘要】
一组快速检测苹果炭疽叶枯病菌对QoI类杀菌剂抗性的引物组合物及检测方法和应用


[0001]本专利技术涉及一组快速检测苹果炭疽叶枯病菌对QoI类杀菌剂抗性的引物组合物及检测方法和应用，属于生物


技术介绍

[0002]由炭疽菌(Glomerella cingulata)引起的苹果炭疽叶枯病是一种流行性很强的新病害，主要危害嘎啦、秦冠等品种的叶片和果实，造成果树早期大量落叶，降低果实品质，严重影响苹果产业的健康发展。由于生产上缺乏有效的抗病品种，目前苹果炭疽叶枯病的防治仍然以化学防治为主。其中，甲氧基丙烯酸酯类(QoIs)杀菌剂吡唑醚菌酯是防治苹果炭疽叶枯病的特效药。然而，随着药剂的长期连续使用，苹果炭疽叶枯病菌对吡唑醚菌酯的抗性群体已经在田间形成，严重降低了药剂的防效。对苹果炭疽叶枯病菌进行吡唑醚菌酯的抗性监测不仅能应用于苹果炭疽叶枯病的抗性流行预警，而且也能为苹果炭疽叶枯病的抗性治理提供用药指导。
[0003]环介导等温扩增(Loop
‑
mediated Isothermal Amplification,LAMP)技术是2000年由日本荣研化学的Notomi博士等专利技术的一种新型核酸等温扩增方法，该方法针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用一种具有链式置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA Polymerase)，在恒温条件下(60℃左右)保温30～90min即可完成扩增反应，效率可达109～10
10
个数量级。LAMP反应过程中产生焦磷酸镁沉淀物，出现浑浊现象，因此通过肉眼即可判定扩增结果，也可添加染料至扩增产物中通过颜色变化进行判断，无需专业的仪器设备，运用普通水浴锅或其他稳定热源即可完成，具有简单、快速、准确、经济等特点。目前，LAMP技术已广泛应用于动植物病害的病原抗药性检测。
[0004]传统的杀菌剂抗性检测或监测的方法主要是通过分离培养病原菌，然后在含药培养基上培养，根据药剂对菌丝生长的抑制作用鉴定是否为抗药性菌株，该方法检测周期较长，从分离到鉴定长达1周，甚至数周，且在病原菌培养过程中存在杂菌污染，给实验结果带来误差。同时，还需投入大量的人力资源，增加检测成本。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对已有苹果炭疽叶枯病菌对QoI类杀菌剂抗性检测方法中存在费时、费力、成本高、准确性低等缺点，提供了一组快速检测苹果炭疽叶枯病菌对QoI类杀菌剂抗性的引物及检测方法和应用，本专利技术具有操作简单、检测周期短、特异性强、灵敏度高等优点。
[0006]专利技术人于2020年在山东省烟台市发现了炭疽叶枯病菌对吡唑醚菌酯的田间抗性菌株，并且通过测序证明细胞色素b基因Cytb第143位密码子由甘氨酸突变为丙氨酸(G143A)，基因Cytb的核苷酸序列为：SEQ ID NO.5。通过人为构建点突变以及真菌原生质体转化技术，证明了Cytb基因1699位核苷酸由G突变为C为炭疽叶枯病菌对吡唑醚菌酯产生抗药性的原因。
[0007]本专利技术的技术方案如下：
[0008]一组快速检测苹果炭疽叶枯病菌对QoI类杀菌剂抗性的引物组合物，由正向内引物FIP，核苷酸序列如SEQ ID NO.1；反向内引物BIP，核苷酸序列如SEQ ID NO.2；正向外引物F3，核苷酸序列如SEQ ID NO.3和反向外引物B3，核苷酸序列如SEQ ID NO.4组成。
[0009]进一步的，所述快速检测苹果炭疽叶枯病菌对QoI类杀菌剂抗性的引物组合物在LAMP检测方法中的应用。
[0010]进一步的，所述LAMP检测方法的建立中，反应条件为58
‑
62℃，60min；检测方法的步骤如下：
[0011](1)提取待测样品的基因组DNA；
[0012](2)LAMP反应体系的建立：
[0013]以步骤(1)提取的DNA为模板，利用引物FIP、BIP、F3和B3进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为20μL，包括FIP和BIP各1.5μL，F3和B3各0.5μL，10
×
ThermoPol Reaction Buffer：2μL，MgSO4：4μL，Betaine：4μL，dNTPs：3.5μL，Bst DNA聚合酶：1μL，DNA模板：1μL，10000
×
SYBR GreenI：0.5μL；
[0014](3)反应条件：58
‑
62℃，60min；优选为62℃；
[0015](4)反应结果观察：LAMP反应产物显示为荧光黄色，电泳图谱呈梯状条带，判断为阳性；LAMP反应产物显示为橙色，电泳图谱无条带，判断为阴性。
[0016]本专利技术与现有技术相比具有以下优点：
[0017](1)简便易行：本专利技术的检测方法克服了现有检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，不能实现快速检测的问题。本专利技术在58
‑
62℃的恒温条件下，能快速、方便、高效地检测到苹果炭疽叶枯病菌对QoI类杀菌剂抗性菌株，不需要复杂和昂贵的仪器，能较好满足对抗性菌株的现场检测。
[0018](2)特异性强：本专利技术在设计和优选引物时，对苹果炭疽叶枯病菌Cytb基因的143位的突变位点上尝试了多种碱基的错配，最终优选出一套能特异性鉴定苹果炭疽叶枯病菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP引物组合物，该方法通过2对引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性大大提高，假阳性出现的概率也随之降低。
[0019](3)灵敏度高：本专利技术的检测方法灵敏度在DNA水平上可达到1
×
10
‑3ng/μL，远高于普通PCR的灵敏度。
[0020](4)准确性高：该方法几乎不受反应混合液中存在的大量外源DNA和杂质的影响，不需要从样本中纯化DNA，可直接利用发病组织提取DNA进行快速检测，大大提高检测准确度。
附图说明
[0021]图1为Cytb基因点突变(G1669C)导致炭疽叶枯病菌对吡唑醚菌酯产生抗性的验证图；
[0022]A：各菌株在AEA培养基中加入50μg/mL的吡唑醚菌酯的生长情况
[0023]B：各菌株在AEA培养基上的生长情况。
[0024]图2为LAMP检测引物筛选；
[0025]A：LAMP显色变化图
[0026]B：LAMP扩增产物电泳图
[0027]S1
‑
S5是根据目的基因点突变设计的5套引物。
[0028]图3为LAMP检测的反应温度优化；
[0029]A：LAMP显色变化图
[0030]B：LAMP扩增产物电泳图
[0031]图4为LAMP检测的反应时间优化；
[0032]A：LAMP显色变化图
[0033]B：LAMP扩增产物电泳图
[0034]图5为LAMP检测的特异性优化；
[0035]A：LAMP显本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组快速检测苹果炭疽叶枯病菌对QoI类杀菌剂抗性的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物由正向内引物FIP，核苷酸序列如SEQ ID NO.1；反向内引物BIP，核苷酸序列如SEQ ID NO.2；正向外引物F3，核苷酸序列如SEQ ID NO.3和反向外引物B3，核苷酸序列如SEQ ID NO.4组成。2.如权利要求1所述的快速检测苹果炭疽叶枯病菌对QoI类杀菌剂抗性的引物组合物在LAMP检测方法中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述LAMP检测方法的建立中，反应条件为58
‑
62℃，60min。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述LAMP检测方法的步骤如下：(1)提取待测样品的基因组DNA；(2)LAMP反应体系的建立：以步骤(1)提取的DNA为模板，利用引物F...

【专利技术属性】
技术研发人员：任维超，王思佳，刘娜，练森，董向丽，李保华，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：