一种利用秸秆制备植物高效促生剂的方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种利用秸秆制备植物高效促生剂的方法及其应用。所述的方法包括利用膨胀蛋白TgS或膨胀蛋白TgS协同纤维素酶在0.1MNaAC

【技术实现步骤摘要】
一种利用秸秆制备植物高效促生剂的方法及其应用


[0001]本专利技术属于植物有效促生剂，涉及一种利用秸秆制备植物高效促生剂的方法及其应用。

技术介绍

[0002]添加植物生长促生剂对经济类植物的产量和品质提高有着至关重要的作用，而农作物秸秆可以为制备植物促生剂提供优质的原料，但秸秆如何高效应用于植物促生方面仍在探索。现有的农作物秸秆制糖工艺过程中，需要利用亚氯酸钠等化学品脱除木质素，然后经洗脱分离获得较纯的纤维素和半纤维素。在此前的技术中，常见用硫酸将纤维素原料预处理，但现有的生产技术上，无论是利用酸解或是纤维素酶分解得到还原糖，都需要经过严格的离子交换脱盐和浓缩，同时也会造成环境污染。除此之外，以往酸处理的技术会导致半纤维素先水解为五碳糖，在秸秆中主要是木糖。木糖的存在会影响纤维素酶的水解作用，无论是水解技术上去除木糖还是将产物分离，这都将导致成本的增加。

技术实现思路

[0003]本专利技术的另一目的在于提供一种膨胀蛋白TgS的应用。
[0004]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0005]一种利用秸秆制备植物促生剂的方法，所述的方法包括利用膨胀蛋白TgS或膨胀蛋白TgS协同纤维素酶在0.1M NaAC
‑
HAC缓冲液中50
‑
60℃下处理秸秆45
‑
50h，将反应过后的固液混合物通过固液分离机进行分离，固体部分为未分解完的秸秆，暗棕色液体为植物促生剂提取液；其中，所述的膨胀蛋白TgS的编码序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]作为本专利技术的一种优选，秸秆在NaAC
‑
HAC缓冲液中的配比为18
‑
22％，优选20％(W/V％)。
[0007]作为本专利技术的一种优选，膨胀蛋白TgS在NaAC
‑
HAC缓冲液中的终浓度为0.1
‑
0.5mg
·
mL
‑1，优选0.2mg
·
mL
‑1。
[0008]作为本专利技术的一种优选，纤维素酶在NaAC
‑
HAC缓冲液中的酶活为10
‑
18FPU，优选15FPU。
[0009]作为本专利技术的一种优选，利用膨胀蛋白TgS协同纤维素酶处理秸秆时，TgS和纤维素酶一起与秸秆一起反应40
‑
50小时。
[0010]作为本专利技术的一种优选，所述的秸秆为玉米、水稻。
[0011]按照本专利技术所述的方法制备得到的植物促生剂。
[0012]本专利技术所述的植物促生剂在促进作物生长中的应用。
[0013]作为本专利技术的一种优选，所述的植物为黄瓜。
[0014]本专利技术相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
[0015]植物促生剂可以有效促进植物的生长并提高作物的品质和产量，减少农用化学品的投入。秸秆作为一种绿色环保的重要天然资源，可以作为植物促生剂研发的重要原料。本
专利技术的落脚点就在于，膨胀蛋白TgS可高效溶胀秸秆中木质纤维素并提高纤维素酶的可及度，促进大量的有效成分(还原糖和功能性物质)的释放，经除杂、浓缩后对植物有显著促生效果。该技术具有秸秆循环利用、化肥减施、土壤培肥、抗逆增产提质等多重功能，符合农业高质量发展、绿色发展的需求。
附图说明
[0016]图1膨胀蛋白TgS 12％SDS
‑
PAGE观察结果
[0017]图2膨胀蛋白TgS溶胀秸秆后的原子力显微镜观察结果
[0018]图3膨胀蛋白TgS提高纤维素酶活力结果
[0019]图4膨胀蛋白TgS显著提高秸秆糖的释放
[0020]图5膨胀蛋白TgS显著提高秸秆植物促生物质的释放
[0021]图6新型植物促生剂对植物促生效果图
具体实施方式
[0022]实施例1贵州木霉NJAU4742(CGMCC NO.12166)中Tgs基因在大肠杆菌中优化的异源表达
[0023]1.pET32a
‑
TEE
‑
Tgs优化助溶标签表达载体的构建
[0024]1)首先双酶切将pET32a质粒载体线性化，
[0025]位点如下：5
’‑
EcoR1，3
’‑
HindⅢ。
[0026]50uLXba1酶切体系为：
[0027]50mM Tris
‑
HCl(pH7.5 at 37℃)，10mM MgCl2，100mM NaCl，0.02％Triton X
‑
100，0.1mg
·
mL
‑1BSA。1ug pET32a质粒载体，1U Xba1酶。
[0028]50uLHindⅢ酶切体系为：
[0029]10mM Tris
‑
HCl(pH7.5 at 37℃)，10mM MgCl2，50mM NaCl，1mM Dithiothreitol，1ug pET32a质粒载体，1UHindⅢ酶。
[0030]2)准备酶连片段：TRX+His+TgS
[0031]Pet32a载体上自带TrxA含有多个蛋白酶切位点，在蛋白酶切后，其容易在TgS前遗留过多氨基酸片段影响活性。因此本专利技术通过XbaI切除原有标签，改用优化的TRX标签，优化的标签如SEQ ID NO.3所示。
[0032]为了便于Ni柱吸附纯化在优化的TRX标签后加入6*His：HHHHHH，得到TrxA
‑
His标签。优化过后的TrxA
‑
His标签加入具有高效蛋白酶切效率的TEV酶酶切位点：SSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMGENLYFQG，解决TgS蛋白N端多余长氨基酸片段遗留问题；最终获得的TTE
‑
His标签如SEQ ID NO.4所示；TgS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；TTE
‑
His+TgS完整核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。此酶连片段TTE
‑
His+TgS通过公司序列合成，酶连末端位点为Xba1、HindⅢ。将上述合成的TTE
‑
His+TgS片段通过T4连接酶连接线性化的pET32a质粒载体。
[0033]反应条件设置如下：20uL体系(16℃反应30min)，50mM Tris，pH 7.5，10mM MgCl2，10mM DTT，1mMATP，25μg
·
mL
‑1BSA Tgs片段和线性化的载体各1.5ug，2U T4连接酶。
[0034]3)大肠杆菌转化与质粒复制，将获得的重组质粒热击转化入大肠杆菌DH5α：
[0035]重组质粒产物——5μL
[0036]DH5α感受态细胞——100μL冰浴30min后42℃热击90s，置于冰上，室温下添加LB培养基8本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用秸秆制备植物促生剂的方法，其特征在于，所述的方法包括利用膨胀蛋白TgS或膨胀蛋白TgS协同纤维素酶在0.1M NaAC
‑
HAC缓冲液中50
‑
60℃下处理秸秆45
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50h，将反应过后的固液混合物通过固液分离机进行分离，固体部分为未分解的秸秆，暗棕色液体为植物促生剂提取液；其中，所述的膨胀蛋白TgS的编码序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，秸秆在NaAC
‑
HAC缓冲液中的配比为18
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22％(w/v)，优选20％(w/v)。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，膨胀蛋白TgS在NaAC
‑
HAC缓冲液中的终浓度为0.1
‑
0.5mg
·
mL

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书一页说明书六页序列表电子公布附图三页，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：