一种抗黑色素生成功效评价方法技术

本发明专利技术公开一种黑点青鳉鱼卵的孵育方法及抗黑色素生成功效评价方法。包括授试对象为发育正常的黑点青鳉受精卵；孵育装置为微孔板；培养环境为含氧淡水；整个受精卵暴露实验持续3～5天；利用光学显微镜观察青鳉胚胎，记录黑斑出现与否等生长情况。鉴于此，本发明专利技术方法可以作为抑制黑色素形成药物的粗筛模型，尤其可用于护肤功效方面的探索性研究。绝大多数美白产品的机理都是围绕着皮肤中黑色素的产生和代谢工作的。所以有助于发现一些抑制黑色素生成的活性物质。素生成的活性物质。素生成的活性物质。

【技术实现步骤摘要】
一种抗黑色素生成功效评价方法


[0001]本专利技术涉及生物医学
，尤其涉及一种黑点青鳉鱼卵的孵育方法及抗黑色素生成功效评价方法。

技术介绍

[0002]黑色素是动植物中存在的一种黑褐色的色素，是酪氨酸或3,4
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二羟苯丙氨经过一连串化学反应所形成，黑色素通常以聚合的方式存在。正是由于黑色素的存在，皮肤才有了颜色。所以绝大多数美白产品的机理都是围绕着皮肤中黑色素的产生和代谢工作的。要达成美白功效，需要使用一些有助于抑制黑色素生成的物质。
[0003]目前抗黑色素生成的实验方法，主要是以动物细胞(如小鼠的黑色素瘤细胞)或者通过人体皮肤细胞为模型，通过光谱、生化实验、电子显微镜等专业仪器测试酪氨酸活性等生化指标来完成，细胞培养成本高，实验过程繁琐。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种成本低且直观的抗黑色素生成功效评价实验方法。
[0005]鱼类作为全球生态系统中种群数量最大且生物多样性最高的动物群体之一，具有重要的生态功能和经济价值。除了作为人类生长发育所需蛋白质或其它营养物质的重要来源，它们还可以作为人类健康风险评估重要的指示生物。鱼类早期发育阶段指的是从受精卵开始，经胚胎发育到仔鱼的整个过程。这一阶段是鱼类整个生命周期中对周围环境最为敏感的时期。因此，利用鱼类早期发育阶段(胚胎或仔鱼)开展研究，可以更加准确而且迅速地得出研究结论。本专利技术在众多鱼类中发现了黑点青鳉鱼可能可以解决本专利技术的目的。黑点青鳉鱼为脊索动物门
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辐鳍亚纲
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颌针鱼目
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怪颌鳉科
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青鳉属，具有繁殖周期短(3～4个月)、胚胎透明方便观察、易于大规模繁育以及早期发育阶段响应敏感等优势。目前黑点青鳉都是在鱼缸中用海水养殖，这样用于暴露实验时所需的试剂量很大，而且海水获取相对繁琐，实验成本昂贵，高昂的成本将阻碍大规模实验的开展。为了降低实验成本，科研人员采用培养皿孵育和养殖鱼卵或者幼鱼做暴露实验。培养皿是一种用于微生物或细胞培养的实验室器皿，由一个平面圆盘状的底和一个盖组成，常用规格的培养皿加液量一般在50～150ml。培养皿作为承载物，虽然能减少暴露实验的试剂使用量，但是实验阶段活性物质的获得量一般非常少，可能仅有毫克级别，这么微量的活性物质是远远不能满足培养皿承载物开展活性物质功效评价的数量(或浓度)需求的。
[0006]本专利技术突破性采用了微孔板技术，既可以降低养殖成本，同时有效地解决了待测试活性样品仅微量可用的现实问题。微孔板是平板具有多个“孔”用作小试管，底部形状的不同可分为平底和圆底(U型和V型)；微孔板的孔数有6、12、24、48、96、384、1536孔等；微孔板由多种材料制成，最常见的制造工艺是注塑成型，使用聚苯乙烯、聚丙烯和环烯烃等材料来满足不同的温度和耐化学性需求。
[0007]如何建立一种成本低廉的黑点青鳉胚胎的孵育方式，并用于抗黑色素生成功效评
价，是本专利技术需要研究解决的技术问题。
[0008]针对以上技术问题，本专利技术一方面提供一种基于微孔板的黑点青鳉受精卵的孵育方法；另一方面，本专利技术提供利用黑点青鳉胚胎模型进行抗黑色素生成功效评价实验方法。
[0009]本专利技术的技术方案如下：
[0010]一种黑点青鳉鱼卵的孵育方法，包括如下步骤：
[0011]步骤1、对黑点青鳉受精卵进行分离操作，分离后的青鳉受精卵放入孵化装置孵化，
[0012]步骤2、向孵化装置注入培养液，孵化温度为20℃～25℃，孵化时间为3d～5d,孵化期间不更换培养液，
[0013]步骤3、用显微镜观察黑点青鳉受精卵，所述孵化装置为微孔板，培养液为含氧淡水，孵育方式为静态暴露。
[0014]在一些实施例中，所述青鳉受精卵分离操作为物理法分离的一种或多种，和/或所述的受精卵分离操作为轻轻揉搓，黑点青鳉的受精卵为粘性卵，表面众多的绒毛使其容易导致聚集成团。因此，需要用轻轻揉搓的方法将受精卵分开，避免相互粘连而影响黑点青鳉的胚胎发育。
[0015]在一些实施例中，所述的青鳉受精卵为发育正常的受精卵，将发育正常的受精卵转移至微孔板中培养，室温控制在20～25℃，光照周期比如正常白天黑夜比，或者所述孵化光暗周期比为14h:10h。
[0016]在一些实施例中，所述静态暴露为孵育期间不加氧，不振动。
[0017]在一些实施例中，所述的孵化装置微孔板为长方形塑料板，长度128大约毫米，宽度大约86毫米，高度大约22毫米；颜色为无色透明板；规格6、12、24、48、96、384孔，每个微孔板中放置黑点青鳉的鱼卵为2～15枚，每孔中加入含氧淡水，试验期间不换水。
[0018]在一些实施例中，所述黑点青鳉鱼卵的孵育方法，包括以下步骤：
[0019]S1，用吸管小心将鱼卵从繁殖缸底部吸出。黑点青鳉的受精卵为粘性卵，表面众多的绒毛使其容易导致聚集成团。因此，需要用轻轻揉搓的方法将受精卵分开，避免相互粘连而影响黑点青鳉的胚胎发育。
[0020]S2，将发育正常的受精卵转移至微孔板中用含氧淡水培养，室温控制在20～25℃，光照周期比如正常白天黑夜比。
[0021]S3，盖上微孔板盖板，整个胚胎孵育实验可持续数日，试验期间不用换水或者补水。
[0022]另一方面，提供一种黑点青鳉受精卵进行评价抗黑色素功效的方法，其包括：
[0023]S4,设置阳性对照组、空白对照组、以及一个浓度或者多个不同浓度的加药组。每个孔中加入一定体积的含氧淡水和药物，孵育基体终体积为1～3mL。
[0024]S5，整个受精卵暴露实验持续3～5天，采用静态暴露的方式进行暴露实验。所谓静态暴露就是孵育期间不加氧，不振动。
[0025]S6，暴露实验结束后，通过显微镜分别从每个孔中观察黑点青鳉鱼卵，记录每一个鱼卵是否出现黑斑，并计数。
[0026]在一些实施例中，每一个试验组用于功效评价的黑点青鳉鱼卵不低于24枚。
[0027]在一些实施例中，所述步骤S6之后，还包括利用如下公式计算药物对黑色素生成
的抑制率：
[0028]抑制率(％)＝∑(每孔无黑斑率(％)
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空白平均无黑斑率(％))/n，其中，n为测试孔的总数量。
[0029]本专利技术提供的技术方案带来的有益效果是：
[0030]本专利技术提供了一种利用微孔板作为孵育鱼卵的介质，普通微孔板是无色透明材质，满足受精卵在孵育过程中需要光照的条件，黑点青鳉属于海水鱼，本专利技术采用淡水孵育技术，与传统的鱼缸海水养殖相比，此淡水孵育方法不仅操作简单，而且消除了海水对药品活性的干扰。
[0031]普通微孔板的每个孔通常仅可容纳几毫升的液体，这将极大减少对测试样品量的要求，而且一般微孔板都有编号，可以准确标识不同品种、不同浓度的试样，这对规模化应用黑点青鳉模式鱼类进行科学研究具有重要意义。与动物细胞(如小鼠的黑色素瘤细胞)或者通过人体皮肤细胞模型，本专利技术抗黑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种黑点青鳉鱼卵的孵育方法，其特征在于，包括：步骤1、对黑点青鳉受精卵进行分离操作，分离后的青鳉受精卵放入孵化装置孵化，步骤2、向孵化装置注入含氧淡水，孵化温度为20℃～25℃，孵化时间为3d～5d,孵化期间不更换培养液，用显微镜观察黑点青鳉受精卵，所述孵化装置为微孔板，培养液为含氧淡水，孵育方式为静态暴露。2.根据权利要求1所述孵育方法，其特征在于，所述青鳉受精卵分离操作为物理法分离的一种或多种，和/或所述的受精卵分离操作为轻轻揉搓。3.根据权利要求1所述孵育方法，其特征在于，所述的青鳉受精卵为发育正常的受精卵，所述孵化光暗周期比为14h:10h。4.根据权利要求1所述孵育方法，其特征在于，所述静态暴露为孵育期间不加氧，不振动。5.根据权利要求1所述孵育方法，其特征在于，所述的孵化装置微孔板为长方形塑料板，长度128毫米，宽度86毫米，高度22毫米；颜色为无色透明板；规格6、12、24、48、96、384孔。6.一种黑点青鳉受精卵进行评价抗黑色素功效的方法，其特征在于，包括：步骤1、设置对照组、实验组，每组进行如下操作，步骤2、对黑点青鳉受精卵进行分离操作...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩大雄，陈茂立，叶国栋，董康梅，许剑雄，李强，王海燕，杨燕燕，张志荣，
申请(专利权)人：艾斯颂扬州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：