一种不受Hrd1泛素化降解的突变CDVH蛋白、突变CDV病毒及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种不受Hrd1泛素化降解的突变CDVH蛋白、突变CDV病毒及应用，属于生物技术领域。对CDVH蛋白的第115位点氨基酸进行K115R突变，使得突变的CDVH蛋白不能被E3泛素连接酶Hrd1介导的泛素蛋白酶体途径泛素化降解，通过反向遗传技术拯救CDVH蛋白K115R突变的病毒，该突变病毒H蛋白不能被E3泛素连接酶Hrd1介导的泛素蛋白酶体泛素化降解，病毒滴度高于原有毒株。突变的CDVH蛋白和突变的病毒作为疫苗抗原，能够提高抗体水平，增强免疫效果，为CDV的疫病防控提供潜在的控制措施。疫病防控提供潜在的控制措施。疫病防控提供潜在的控制措施。

【技术实现步骤摘要】
一种不受Hrd1泛素化降解的突变CDV H蛋白、突变CDV病毒及应用


[0001]本专利技术涉及一种不受Hrd1泛素化降解的突变CDVH蛋白、突变CDV病毒及应用，属于生物


技术介绍

[0002]犬瘟热(canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)引起的一种高度接触性传染病，具有上皮细胞、淋巴细胞和神经细胞的趋向性，可导致全身感染，主要引起呼吸道，消化道，泌尿系统，淋巴系统，皮肤，骨骼和中枢神经系统疾病。CDV给毛皮动物和犬产业造成了严重的经济损失，对野生动物保护构成了重要威胁。但近年来全球CD的发病率有所上升。有报道CDV跨物种感染非人类灵长类动物，这也引起了人们对人类CDV潜在的人畜共患风险的一些担忧。因此，CDV仍然是一种重要的全球流行性传染病。
[0003]CDV的基因组是一个包含15690个核苷酸的单链负RNA，包括6个编码核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、Large(L)、基质(M)、血凝素(H)、融合蛋白(F)和非编码区(UTRs)的区域。其中H蛋白作为一种包膜蛋白与特定的宿主细胞受体(SLAM、nectin
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4或其他)相互作用，从而决定病毒嗜性。H蛋白也能构诱导机体产生中和抗体，在犬瘟热病毒的免疫保护中发挥重要的作用。接种疫苗是防控CDV感染的主要策略，但CDV在细胞中的培养滴度不高，制约了CDV疫苗的研制与发展，目前仍然存在免疫失败的现象。如何维持和增加免疫保护性抗原H蛋白含量，提高病毒复制能力，从而刺激产生更多抗体是目前CDV疫苗创制中亟待解决的问题之一。
[0004]宿主蛋白Hrd1具有E3泛素连接酶活性，对包括病毒蛋白在内的多种底物蛋白进行泛素化修饰，并介导其通过蛋白酶体途径降解。对于CDV而言，目前还未见报道。我们通过质谱发现Hrd1与CDV H蛋白互作，生物信息学预测CDV H蛋白含有7个赖氨酸可作为潜在的泛素化修饰位点。目前Hrd1对于CDVH蛋白稳定性的影响并未得到研究。

技术实现思路

[0005]技术问题
[0006]为了避免CDV主要保护性抗原H蛋白在细胞中的降解，维持其蛋白稳定性的问题，本专利技术的目的在于提供一种不受E3泛素连接酶Hrd1泛素蛋白酶体降解的突变CDV H蛋白、突变病毒及应用。该突变CDV H蛋白在细胞中不被Hrd1介导的泛素化蛋白酶体途径降解，该突变病毒在细胞中病毒滴度高，可替代原有CDV疫苗株，提高免疫保护效果和有利于抗病毒药物的开发。
[0007]技术方案
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]一种不受Hrd1泛素化降解的突变CDV H蛋白，其特征在于：该突变CDV H蛋白在细胞的泛素化蛋白酶体途径的泛素化降解中保持完整性。
[0010]所述的泛素化蛋白酶体途径的泛素化降解是由宿主Hrd1蛋白介导。所述CDV H蛋白的突变氨基酸位点位于CDV H蛋白上自氨基端起第115位氨基酸。
[0011]所述突变的CDV H蛋白是H蛋白发生K115R突变的CDV H蛋白。
[0012]含有所述突变CDV H蛋白的突变CDV病毒，其特征在于：该突变的CDV病毒的H蛋白在细胞的泛素化蛋白酶体途径的泛素化降解中保持完整性。
[0013]所述的突变CDV病毒，其特征在于：所述泛素化蛋白酶体途径的泛素化降解是由宿主Hrd1蛋白介导。
[0014]所述的突变CDV病毒，其特征在于：所述CDV病毒的突变氨基酸位点位于CDV H蛋白上自氨基端起第115位氨基酸。
[0015]所述的突变CDV病毒，其特征在于：所述突变的CDV病毒是H蛋白发生K115R的突变CDV病毒。
[0016]所述的突变CDV病毒的制备方法，其特征在于：通过点突变PCR对CDV病毒的H蛋白进行K115R突变，重叠PCR将K115R突变的H蛋白基因引入CDV基因组序列，同时在该基因组序列两端引入锤头核酶及丁肝核酶序列，然后连接到PCI质粒，与CDV N、P、L蛋白质粒为辅助质粒共转染细胞，即为制备的不受Hrd1泛素化降解的突变CDV病毒。
[0017]所述的突变CDV H蛋白可以在制备CDV疫苗中应用。
[0018]所述的突变CDV病毒可以在制备CDV疫苗中应用。
[0019]所述的突变CDV病毒可以在CDV感染细胞模型中应用。
[0020]有益效果
[0021]本专利技术的第一个方面是提供一种突变的CDV H蛋白，该突变CDV H蛋白在细胞内泛素化蛋白酶体途径的降解中保持完整性。所述泛素蛋白酶体途径的泛素化降解由宿主细胞E3泛素连接酶Hrd1蛋白介导。所述突变CDV H蛋白的突变位点位于CDV H蛋白上自氨基端起第115位氨基酸，是Hrd1介导的CDV H蛋白泛素化位点，该位点由赖氨酸突变为精氨酸，使得H蛋白不能被E3泛素连接酶Hrd1介导的泛素化蛋白酶体途径降解。
[0022]本专利技术通过反向遗传拯救突变CDV病毒，使其H蛋白发生K115R突变。其制备过程包括：通过点突变PCR对H蛋白进行K115R突变，重叠PCR将K115R突变的H蛋白基因引入CDV基因组序列，同时在该基因组序列两端引入锤头核酶及丁肝核酶序列，然后连接到PCI质粒，以CDVN、P、L蛋白质粒作为辅助质粒共转染细胞，拯救出突变病毒。用上述突变的CDV病毒感染Vero细胞，病毒的复制能力增强，病毒滴度提高。用上述突变的CDV H蛋白作为DNA疫苗，免疫小鼠，增加了CDVH蛋白的抗体水平。用上述突变的CDV病毒免疫犬，提高了中和抗体水平，增强了免疫效果。
[0023]本专利技术具有以下有益效果：
[0024]本专利技术是基于宿主E3泛素连接酶Hrd1介导CDV H蛋白自氨基端起第115位氨基酸位点发生泛素化修饰而通过蛋白酶体途径降解的发现。
[0025]通过制备不能被Hrd1蛋白介导的泛素化蛋白酶体途径降解的突变CDV H蛋白、突变CD病毒，从而维持CDVH蛋白的稳定水平和获得具有高复制能力的突变CDV病毒，其毒价显著高于原有CDV毒株，可以作为更优良的疫苗候选抗原，为CDV暴发提供潜在的控制措施。
[0026]本专利技术构建的115位氨基酸位点突变的CDV H蛋白制备成DNA疫苗，通过泛素化试验证实Hrd1不能介导突变CDV H蛋白的泛素化降解作用，能维持H蛋白在细胞中的稳定性，
增强犬瘟热的免疫保护效果；
[0027]本专利技术构建的H蛋白不能被Hrd1泛素化降解的突变CDV病毒，制备成DNA疫苗感染犬后能使动物体内抗体水平明显升高；突变的CDV通过细胞感染实验发现突变的CDV病毒毒价显著高于原有毒株，感染犬后相比原有CDV病毒载量显著提升，也能增加抗体水平，完全可以替代原有疫苗株CDV来创制CDV疫苗，并对CDV防控药物的研发有着重要的意义。
附图说明
[0028]图1为Hrd1与CDV H蛋白互相作用的鉴定；其中；A为细胞过表达Flag
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种不受Hrd1泛素化降解的突变CDVH蛋白，其特征在于：该突变CDVH蛋白在细胞的泛素化蛋白酶体途径的泛素化降解中保持完整性。2.根据权利要求1所述的突变CDVH蛋白，其特征在于：所述的泛素化蛋白酶体途径的泛素化降解是由宿主Hrd1蛋白介导，所述的突变CDVH蛋白的突变氨基酸位点位于CDVH蛋白上自氨基端起第115位氨基酸。3.根据权利要求1或2所述的突变CDVH蛋白，其特征在于：所述的突变CDVH蛋白是发生K115R突变的CDVH蛋白。4.含有权利要求1
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3之一所述突变CDVH蛋白的突变CDV病毒，其特征在于：该突变CDV病毒的H蛋白在细胞的泛素化蛋白酶体途径的泛素化降解中保持完整性。5.根据权利要求4所述的突变CDV病毒，其特征在于：所述的泛素化蛋白酶体途径的泛素化降解是由宿主Hrd1蛋白介导，所述的突变CDV病毒的突变氨基酸位点位于CDVH蛋白上自氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕振威，王文杰，徐立波，宋素泉，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：