一种在生殖免疫中NK细胞活性检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种在生殖免疫中NK细胞活性检测的方法，具体的是一种对NK细胞分泌的杀伤性细胞因子及表达于细胞表面的活性受体进行检测试剂盒，从而对NK细胞活性进行综合评价，检测了细胞分泌的颗粒酶B(GZMB)，γ干扰素和CD107a三个代表性分子，从NK细胞的自身特性出发，找到NK细胞功能异常的内在原因，将更有效地反应患者的生殖免疫问题所在。效地反应患者的生殖免疫问题所在。

【技术实现步骤摘要】
一种在生殖免疫中NK细胞活性检测的方法


[0001]本专利技术涉及生物免疫
，具体涉及一种在生殖免疫中NK细胞活性检测的方法。

技术介绍

[0002]自然杀伤细胞(NK细胞)占外周血淋巴细胞的5
‑
10％，占子宫内膜淋巴细胞70
‑
90％，在人类妊娠过程中发挥着重要作用。NK细胞通过其活化性及抑制性受体，识别靶细胞，并对异己的靶细胞产生杀伤活性。外周血和子宫内膜NK细胞的数量、表型以及活性对于维持正常的妊娠至关重要，妊娠失败的女性，往往伴随NK细胞比例、数量以及表型、细胞因子分泌等功能的异常，表明NK细胞与复发性流产、反复种植失败以及子痫前期的发生密切相关。
[0003]目前已有较多研究表明，NK细胞活性与妊娠结局相关。孕前具有高水平外周血NK细胞活性与复发性流产相关。有些患者胚胎染色体正常，而外周血NK细胞比例及活性均较成功妊娠女性显著升高。能够维持妊娠并活产的妇女，往往在孕早期(6
‑
9周)，NK细胞活性会发生显著下降，相反，发生流产的妇女NK细胞活性则要较正常对照组显著升高。除此之外，IL
‑
2的升高也可导致NK细胞活性增加，进一步增加复发性流产和反复种植失败的可能性。
[0004]综上，我们不难发现，NK细胞活性检测，对于复发性流产(Recurrent spontaneous abortion，RSA)及反复种植失败(Repeated planting failure，RIF)人群的免疫因素诊断、治疗以及具有不良妊娠史的早孕人群妊娠状态的判断具有重要的指导意义。然而，目前临床的检验项目仅能判断NK细胞的比例，对其活化状态难以判定。

技术实现思路

[0005]针对上述技术背景中的问题，本专利技术的一个目的在于提供一种在生殖免疫中NK细胞活性检测的方法，具体的是一种对NK细胞分泌的杀伤性细胞因子及表达于细胞表面的活性受体进行检测试剂盒，从而对NK细胞活性进行综合评价，从NK细胞的自身特性出发，找到NK细胞功能异常的内在原因，将更有效地反应患者的生殖免疫问题所在。
[0006]为了实现以上目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0007]一种在生殖免疫中NK细胞活性检测的方法，具体方法如下：
[0008]S1、NK细胞比例检测：
[0009]S1.1：收集待检测NK细胞进行重悬并计数，取1
×
106个细胞，使用荧光素对抗体CD3、CD56、CD16进行荧光标记，避光孵育，得到第一细胞液；
[0010]S1.2：利用流式细胞仪检测所述第一细胞液，得到NK细胞数的比例，即NK细胞在人外周血中占比；
[0011]S2、NK细胞活化性细胞因子表达检测
[0012]S2.1：收集待检测NK细胞计数进行重悬，加入淋巴细胞刺激剂、带荧光标签的
PEcy7
‑
CD107a抗体，混匀孵育，得到第二细胞液；
[0013]S2.2：在第二细胞液中，加入带有荧光标签的FITC
‑
GZMB抗体，带有荧光标签的PE
‑
IFN
‑
γ抗体，带有荧光标签的APC
‑
CD107a抗体，带有荧光标签的APC
‑
PEcy7
‑
GZMB抗体，孵育，得到第三细胞液；
[0014]S2.2：利用流式细胞仪检测所述第三细胞液，分析GZMB以及IFN
‑
γ的表达情况。
[0015]进一步地，所述S1中荧光抗体标记所用荧光素选择APC、FITC、Pre
‑
Cy5。
[0016]进一步地，所述S1进行荧光抗体标记得到：带有荧光标签的APC
‑
CD3抗体，带有荧光标签的FITC
‑
CD56抗体，带有荧光标签的Pre
‑
Cy5
‑
CD16抗体。
[0017]进一步地，所述S2.2中第二细胞液中：
[0018](1)加入1
×
PBS混匀，离心；标记FITC
‑
GZMB，PE
‑
IFN
‑
γ，APC
‑
CD107a，孵育30；
[0019](2)PBS洗涤一次，离心，弃掉上清，加入固定液固定1h，加入穿膜液洗涤一次，离心，弃掉上清；
[0020](3)加入穿膜液重悬细胞沉淀，加入APC
‑
PEcy7
‑
GZMB，PE
‑
IFN
‑
γ，标记1h；
[0021](4)加入1
×
PBS洗涤一次，离心，弃掉上清，用PBS重悬细胞沉淀，获得标记后细胞，利用流式细胞仪进行检测。
[0022]本专利技术的另一目的在于，提供如一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，其用于实施如上所述的NK细胞活性检测的方法，由7种带有荧光素标签的抗体组成。
[0023]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0024]人外周血中NK细胞占比约5
‑
15％，具有杀伤肿瘤和病毒感染的细胞的能力，并且可以分泌多种细胞因子。在外周血中主要有约90％的CD56dimCD16+NK细胞和约10％的CD56brightCD16
‑
NK细胞，前者被认为更具有杀伤活性，而后者被认为分泌多种细胞因子，如IFN
‑
γ，TNF
‑
β，IL
‑
10，IL
‑
13和颗粒酶(GZMB)、穿孔素等。前期我们研究发现有不良妊娠史的患者具有更高的NK细胞比例和更强的活化性受体信号通路，那么它们分泌的活化性功能分子水平是否也具有显著差异呢？因此我们分别检测了细胞分泌的颗粒酶B(GZMB)，γ干扰素和CD107a三个代表性分子。
[0025]本专利技术利用流式检测，对NK细胞分泌的杀伤性细胞因子及表达于细胞表面的活性受体进行检测，再对NK细胞活性进行精准评价，利用分泌型细胞因子及膜表达活化性受体的检测表征NK细胞活性，进而指导临床用药。
[0026]说明书附图
[0027]图1：复发性流产和反复种植失败患者外周血NK细胞比例统计；
[0028]图2：复发性流产和反复种植失败患者NK细胞Granzyme B表达水平统计；
[0029]图3：复发性流产和反复种植失败患者NK细胞IFN
‑
γ表达水平统计；
[0030]图4：复发性流产和反复种植失败患者NK细胞CD107a表达水平统计；
[0031]图5：复发性流产和反复种植失败患者接受治疗前后Granzyme B表达统计；
[0032]图6：复发性流产和反复种植失败患者接受治疗前后IFN
‑
γ表达统计；
[0033]图7：复发性流产和反复种植失败患者接受治疗前本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在生殖免疫中NK细胞活性检测的方法，其特征在于，具体方法如下：S1、NK细胞比例检测：S1.1：收集待检测NK细胞进行重悬并计数，取1
×
106个细胞，使用荧光素对抗体CD3、CD56、CD16进行荧光标记，避光孵育，得到第一细胞液；S1.2：利用流式细胞仪检测所述第一细胞液，得到NK细胞数的比例；S2、NK细胞活化性细胞因子表达检测S2.1：收集待检测NK细胞计数进行重悬，加入淋巴细胞刺激剂、带荧光标签的PEcy7
‑
CD107a抗体，混匀孵育，得到第二细胞液；S2.2：在第二细胞液中，加入带有荧光标签的FITC
‑
GZMB抗体，带有荧光标签的PE
‑
IFN
‑
γ抗体，带有荧光标签的APC
‑
CD107a抗体，带有荧光标签的APC
‑
PEcy7
‑
GZMB抗体，孵育，得到第三细胞液；S2.2：利用流式细胞仪检测所述第三细胞液，分析GZMB以及IFN
‑
γ的表达情况。2.根据权利要求1所述的一种在生殖免疫中NK细胞活性检测的方法，其特征在于，所述S1中荧光抗体标记所用荧光素选择APC、FITC、Pre
‑
Cy5。3.根据权利要求2所述的一种在生殖免疫中NK细胞活性检测的方法，其特征在于，所述S1进行荧光抗体标记得到：带有荧光标签的APC
‑
CD3抗体，带有荧光标签的FITC
‑
CD56抗体，带有荧光标签的Pre
‑
Cy5
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍加琪，徐龙，张倩，王岩石，许波，
申请(专利权)人：合肥同勉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：