一种富集阪崎肠杆菌的试剂及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种富集阪崎肠杆菌的试剂及其制备方法，该试剂包括包被有阪崎肠杆菌多克隆抗体的免疫磁珠。该试剂可以直接从样品中或前增菌培养液中富集目标微生物，起到浓缩作用，解决了样品前处理的瓶颈问题，提高了检测灵敏度和检出率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于食品微生物安全监测领域，具体地是涉及一种富集阪崎肠杆菌的试剂及其制 备方法。
技术介绍
阪崎肠杆菌(^7tero6scter幼hzsh7)是奶粉中近儿年引起广泛关注的一种致病菌。 阪崎肠杆菌原称黄色阴沟肠杆菌，直到1980年才被认为是一个新的菌种，并以日本微生物学 家——RiichiSakazakii的名字命名，即阪崎肠杆菌。2008年，食品卫生法典委员会同意考 虑创建一个新属Cro/w》scter， Cro/7otecter包括阪崎肠杆菌和相关种。阪崎肠杆菌是人和动 物肠道内寄生的一种革兰氏阴性致病菌，其周生鞭毛、能运动、无芽孢和兼性厌氧。阪崎肠杆菌在自然界的污染源仍然不清楚(Friedemann等，2007; Lin等，2007)，在 多起暴发事件中发现，阪崎肠杆菌的感染与婴幼儿配方奶粉密切相关(Iversen等，2004)。 从大多数病例看，婴幼儿(主要是l岁以下)特别是出生28天以内、早产儿、低体重儿或免 疫缺陷的婴幼儿更容易被阪崎肠杆菌感染，虽然有抗生素的治疗，但总体死亡率高达80%。 不仅如此，阪崎肠杆菌也能引起成人的骨髓炎、菌血症和恶性肿瘤。2002年国际食品微生物 标准化委员会(ICMSF)把阪崎肠杆菌列为"严重危害特定人群，危害生命或慢性实质性后遗 症或长期影响"的一种致病菌。FA0/WH0把阪崎肠杆菌列为婴儿配方奶粉中的A类致病菌。自从阪崎肠杆菌造成的危害得到频频报道后，食品中特别是婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆 菌的检测就显得非常重要。目前大部分实验室都参考美国食品及药品管理局(FDA)于2002 年制定的阪崎肠杆菌分离和计数方法，这是国际上颁布的第一个官方方法。2006年，ISO和国际乳品联盟(IDF)联合公布了 "乳和乳制品中阪崎肠杆菌的检测"方法即IS0/TS 22964 1 IDF/RM210。近年来国内外还发展了针对阪崎肠杆菌的分子生物学检测方法(李兆辉等， 2006; Hassan ctal' 2007)。由于阪崎肠杆菌在奶粉中的污染水平很低(0. 36-66 CFU/100g)， 而且奶粉不是无菌产品，可能会存在各种杂菌的污染，从而在检测阪崎肠杆菌时候会有其他 菌的千扰或者竞争，影响检出率。因此，迫切需要建立新的样品前处理方法，用于富集奶粉 中的阪崎肠杆菌，提高检出率。免疫磁珠是由直径3 5微米，有一定磁性，且分散度良好的微珠经不同单克隆抗体包被 而成的颗粒，而免疫磁珠分离方法(i咖uno-magnetic s印aration, IMS)是于70年代中期 发展起来的一项免疫学技术。IMS用于食源性致病菌检测领域的原理是用特异性抗体包被 在磁珠表面来捕获检样(或增菌液)中的目标致病菌，然后在磁场的作用下被吸附沉淀，使 目标致病菌与影响和干扰检测灵敏度的检样残渣和其他杂菌分离开，起到浓縮作用，从而提 高检测的灵敏度和检出率。如在李斯特氏菌检测中，采用免疫磁珠技术的检出率显著高于标 准培养法，后者检出率仅为前者的36%。IMS方法操作简便，只在检测样品或者增菌液中加入免疫磁珠，室温振荡混匀一定的时 间后，在磁场作用下反复用缓冲液洗涤即可，捕获目标菌的免疫磁珠不用与目标菌分离，直 接进行后续实验。由于IMS方法具有许多优点1、分离速度快，效率高、可重复性好；2、 操作简单，不需要昂贵的仪器设备；3、不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功 能等，因此在微生物检测方面具有很大的优势。目前，用IMS检测食品中常见的沙门氏菌 (Salehi et al， 2007)、单增李斯特菌(Uyttendaele et al， 2000; Yang et al， 2007) 和大肠杆菌0157 (Jenkins et al， 2003; Lee J H et al， 2006)等已渐渐成熟，并且已得到越来越多的应用。而且IMS也己成功用于从实际样品中检测志贺氏菌(Islam et al， 1992)、 副溶血性弧菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、粪链球菌、白色念珠菌、空肠 弯曲菌以及白色葡萄球菌，但尚未有阪崎肠杆菌的免疫磁珠富集方法报道。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题是提供一种富集阪崎肠杆菌的试剂，该试剂可以直接从样品 中或前增菌培养液中富集目标微生物，起到浓缩作用，解决了样品前处理的瓶颈问题，提高 了检测灵敏度和检出率。解决上述技术问题的技术方案如下一种富集阪崎肠杆菌的试剂，包括包被有阪崎肠杆菌多克隆抗体的免疫磁珠。优选地，效价为1: 49000 — 51000的90—110ul含阪崎肠杆菌多克隆抗体的兔免疫血清包被于 浓度为10mg/ral的17 — 23 u 1的She印anti-Rabbit IgG免疫磁珠中制备得到。本专利技术的另一需要解决的技术问题是提供上述富集阪崎肠杆菌的试剂的制备方法。 解决上述技术问题的技术方案如下一种制备上述富集阪崎肠杆菌的试剂的方法，包括以下步骤(1) 取浓度为lOmg/ml的17 —23 ul She印anti-Rabbit IgG免疫磁珠于l.O ml洗涤 缓冲液中，混匀，置于磁力架上4土2 min，弃液体；重复洗涤2 — 5次后，加20 y 1洗涤缓冲液使磁珠重悬其中，得磁珠重悬液；(2) 在步骤(1)所述的磁珠重悬液中加入90 — 110nl (效价为1: 49000 — 51000)含 有阪崎肠杆菌多克隆抗体的兔免疫血清，室温混匀；用洗涤缓冲液容至20 y 1即得所述包被有阪崎肠杆菌多克隆抗体的免疫磁珠。优选地，步骤(1)中，She印anti-Rabbit IgG免疫磁珠的量为20yl;步骤(2)中 含有阪崎肠杆菌多克隆抗体的兔免疫血清量为100 y 1。本专利技术首次建立了阪崎肠杆菌免疫磁珠分离方法。首先，制备阪崎肠杆菌兔免疫血清， 获得多克隆抗体；然后利用多克隆抗体包被免疫磁珠制备阪崎肠杆菌免疫磁珠；最后，对免 疫磁珠的特异性和敏感性进行验证，建立起的高效的样本前处理技术——阪崎肠杆菌免疫磁 珠富集方法，可与传统检测方法、分子检测方法和特异性生化显色检测方法等相结合对阪崎 肠杆菌进行检测，能大大提高检测的灵敏度和检出率，具有更广泛的应用前景。本专利技术所述 的试剂用于富集阪崎肠杆菌，分离简单、有效、省时和省力，为微生物快速检测样品前处理 提供了新的途径。附图说明图1为阪崎肠杆菌标准株纯菌验证富集阪崎肠杆菌免疫磁珠敏感性的示意图。 具体实施例方式实施例l:制备富集阪崎肠杆菌的试剂 1、阪崎肠杆菌免疫血清的制备按常规方法制备含阪崎肠杆菌多克隆抗体的阪崎肠杆菌免疫血清。纯化的阪崎肠杆菌分 别以0.2%、 0.3%的甲醛灭活12 h、 24 h，在固定时间各取1 ml倾注TSA平板37。C培养24h，观察菌的灭活情况。取完全灭活的阪崎肠杆菌，调整浓度至108CFU/ml，取0. 1 ml与等体积的福氏完全佐剂 乳化均匀，皮下多点注射新西兰兔(为了保证成功率，以3只兔子同时做实验)，每隔2周重 复注射一次。最后一次免疫后一周(血清效价达l:50000)给兔子放血取血清，-2CTC保存备用o免疫血清特异性的验证分别取阪崎肠杆菌免疫血清未稀释、2倍稀释及生理盐水各20 u 1置无菌平板不同区域。 实验菌株划线接种NA平板本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种富集阪崎肠杆菌的试剂，其特征是，包括包被有阪崎肠杆菌多克隆抗体的免疫磁珠。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴清平，徐晓可，张菊梅，周艳红，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]