具有改变的大麻素含量的大麻制造技术

本发明专利技术公开了一种表现出改变的四氢大麻酚酸(THCA)和/或大麻二酚酸(CBDA)含量的大麻植物。所述植物包含经修饰的参与四氢大麻酚酸合酶(THCAS)和/或大麻二酚酸合酶(CBDAS)基因表达的基因组基因座，所述基因组基因座包含在调节THCAS和/或CBDAS基因的至少一个等位基因的表达的调节区内的至少一个靶向核苷酸修饰。本发明专利技术进一步公开了生产前述大麻植物的方法。本发明专利技术进一步公开了生产前述大麻植物的方法。本发明专利技术进一步公开了生产前述大麻植物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有改变的大麻素含量的大麻
[0001]专利技术背景


[0002]本专利技术总体上涉及具有改变的大麻素表达和/或改变的大麻素合成酶表达的大麻(Cannabis)植物。更具体地，本公开内容涉及用于控制大麻植物中与大麻素合成相关的基因的方法。

技术介绍

[0003]大麻作为纤维、油、食物的来源并由于其药用性能在整个人类历史上一直被栽培。选择性育种已经生产出用于特定用途的大麻植物，包括高效能大麻(marijuana)品系以及用于纤维和种子生产的大麻(hemp)栽培种。大麻素生物合成和其它感兴趣的性状的分子生物学基础在很大程度上尚未被探索。
[0004]因此，迫切需要开发创新方法来加速大麻改良并使其结果更具有可预测性。在植物育种中的重大障碍包括作为数量性状基础的遗传变异的有限来源、以及选择具有合乎需要的性能的植物所需的育种种质的费时和劳动密集型表型和分子评价。
[0005]有超过113种已知的大麻素，但两种最丰富的天然衍生物是四氢大麻酚(THC)和大麻二酚(CBD)。THC是造成大麻消费的众所周知的精神活性影响的原因，而CBD虽本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含遗传修饰的参与四氢大麻酚酸合酶(THCAS)和/或大麻二酚酸合酶(CBDAS)基因表达的基因组基因座的大麻植物或其细胞，其中所述基因组基因座在调节所述THCAS和/或CBDAS基因的至少一个等位基因的表达的调节区内包含至少一个靶向核苷酸修饰。2.根据权利要求1所述的大麻植物或其细胞，其中与缺乏所述至少一个靶向核苷酸修饰的可比较的对照大麻植物相比，所述靶向核苷酸修饰赋予改变的四氢大麻酚酸(THCA)和/或大麻二酚酸(CBDA)含量。3.根据权利要求1和2中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述植物包含与可比较的对照大麻植物相比升高的THCA、CBDA和/或大麻萜酚酸(CBGA)含量。4.根据权利要求2和3中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述可比较的对照大麻植物具有类似的基因型和/或化学型和/或遗传背景并且缺乏所述至少一个靶向核苷酸修饰。5.根据权利要求1
‑
4中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中通过基因组编辑将所述靶向核苷酸修饰引入在所述THCAS和/或CBDAS基因组基因座的所述调节区处。6.根据权利要求1
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5中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述植物包含表达盒，所述表达盒编码RNA指导的内切核酸酶和至少一种指导RNA(gRNA)，所述gRNA具有与所述至少一个THCAS和/或CBDAS等位基因的所述调节区内的靶序列互补的序列。7.根据权利要求1
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6中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述调节区是启动子区域或终止子区域，其可操作地连接至所述至少一个THCAS和/或CBDAS等位基因的编码区。8.根据权利要求1
‑
7中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述调节区是在所述THCAS和/或CBDAS等位基因的编码序列的5'末端的上游或是在所述THCAS和/或CBDAS等位基因的编码序列的3'末端的下游。9.根据权利要求1
‑
8中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述调节区包含转录因子结合位点、RNA聚合酶结合位点、TATA框或其结构变异的组合。10.根据权利要求1
‑
9中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述靶向核苷酸修饰中断或干扰或下调或沉默编码THCAS和/或CBDAS酶的大麻等位基因序列的转录和/或翻译。11.根据权利要求1
‑
9中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述靶向核苷酸修饰增强或诱导或增加编码THCAS和/或CBDAS酶的大麻等位基因序列的转录和/或翻译。12.根据权利要求1
‑
11中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述THCAS等位基因选自“Finola”(FN)大麻品系的THCAS变体或同源物(FNTHCAS)或PurpleKush(PK)大麻品系的THCAS变体或同源物(PKTHCAS)。13.根据权利要求1
‑
11中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述CBDAS等位基因选自大麻二酚酸合酶
‑
样1(CBDAS2)、“Finola”(FN)大麻品系的CBDAS变体或同源物(FNCBDAS)、或PurpleKush(PK)大麻品系的CBDAS变体或同源物(PKCBDAS)。14.根据权利要求12所述的大麻植物或其细胞，其中所述FNTHCAS选自FNTHCAS
‑
1和FNTHCAS
‑
2等位基因，且所述PKTHCAS选自PKTHCAS
‑
1、PKTHCAS
‑
2、PKTHCAS
‑
3和PKTHCAS
‑
4等位基因。15.根据权利要求13所述的大麻植物或其细胞，其中所述PKCBDAS选自PKCBDAS和PKCBDAS1等位基因。16.根据权利要求1
‑
12和14中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述调节区包
含选自以下的THCAS等位基因的启动子区域的序列：与在SEQ ID NO:1中所示的核酸序列具有至少70％序列同一性或相似性的FNTHCAS
‑
1的启动子(pFNTHCAS
‑
1)或其功能变体、与在SEQ ID NO:2中所示的核酸序列具有至少70％序列同一性或相似性的FNTHCAS
‑
2的启动子(pFNTHCAS
‑
2)或其功能变体、与在SEQ ID NO:3中所示的核酸序列具有至少70％序列同一性或相似性的PKTHCAS
‑
1的启动子(pPKTHCAS
‑
1)或其功能变体、与在SEQ ID NO:4中所示的核酸序列具有至少70％序列同一性或相似性的PKTHCAS
‑
2的启动子(pPKTHCAS
‑
2)或其功能变体、与在SEQ IDNO:5中所示的核酸序列具有至少70％序列同一性或相似性的PKTHCAS
‑
3的启动子(pPKTHCAS
‑
3)或其功能变体、与在SEQ ID NO:6中所示的核酸序列具有至少70％序列同一性或相似性的PKTHCAS
‑
4的启动子(pPKTHCAS
‑
4)或其功能变体、任何其它THCAS等位基因的启动子序列和它们的任何组合。17.根据权利要求1
‑
11、13和15中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述调节区包含选自以下的CBDAS等位基因的启动子区域的序列：与在SEQ ID NO:1150中所示的核酸序列具有至少70％序列同一性或相似性的CBDAS2的启动子(pCBDAS2)或其功能变体、与在SEQ ID NO:1151中所示的核酸序列具有至少70％序列同一性或相似性的FNCBDAS的启动子(pFNCBDAS)或其功能变体、与在SEQ ID NO:1152中所示的核酸序列具有至少70％序列同一性或相似性的PKCBDAS的启动子(pPKCBDAS)或其功能变体、与在SEQ ID NO:1153中所示的核酸序列具有至少70％序列同一性或相似性的PKCBDAS1的启动子(pPKCBDAS1)或其功能变体、任何其它CBDAS等位基因的启动子序列和它们的任何组合。18.根据权利要求1
‑
17中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述靶向核苷酸修饰由gRNA序列诱导，所述gRNA序列与在所述调节区序列内的靶序列或其密码子简并核苷酸序列具有至少70％序列同一性或相似性。19.根据权利要求5和18中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述指导RNA(gRNA)核苷酸序列选自由以下成员组成的集合：a.gRNA，其靶向pFNTHCAS
‑
1且包含与特定核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列，所述特定核苷酸序列选自由以下成员组成的集合：SEQ ID NO:7
‑
91和它们的任何组合；b.gRNA，其靶向pFNTHCAS
‑
2且包含与特定核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列，所述特定核苷酸序列选自由以下成员组成的集合：SEQIDNO.:92
‑
176和它们的任何组合；c.gRNA，其靶向pPKTHCAS
‑
1且包含与特定核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列，所述特定核苷酸序列选自由以下成员组成的集合：SEQIDNO.:177
‑
278和它们的任何组合；d.gRNA，其靶向pPKTHCAS
‑
2且包含与特定核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列，所述特定核苷酸序列选自由以下成员组成的集合：SEQIDNO.:279
‑
419和它们的任何组合；e.gRNA，其靶向pPKTHCAS
‑
3且包含与特定核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列，所述特定核苷酸序列选自由以下成员组成的集合：SEQIDNO.:420
‑
560和它们的任何组合；f.gRNA，其靶向pPKTHCAS
‑
4且包含与特定核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列，所述特定核苷酸序列选自由以下成员组成的集合：SEQIDNO.:561
‑
681和它们的任何组
合；g.gRNA，其靶向pCBDAS2且包含与特定核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列，所述特定核苷酸序列选自由以下成员组成的集合：SEQ IDNO.:682
‑
794和它们的任何组合；h.gRNA，其靶向pFNCBDAS且包含与特定核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列，所述特定核苷酸序列选自由以下成员组成的集合：SEQIDNO.:795
‑
895和它们的任何组合；i.gRNA，其靶向pPKCBDAS且包含与特定核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列，所述特定核苷酸序列选自由以下成员组成的集合：SEQ IDNO.:896
‑
1016和它们的任何组合；和j.gRNA，其靶向pPKCBDAS1且包含与特定核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列，所述特定核苷酸序列选自由以下成员组成的集合：SEQIDNO.:1017
‑
1149和它们的任何组合。20.根据权利要求1
‑
19中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述靶向核苷酸修饰选自由以下成员组成的集合：插入、缺失、单核苷酸多态性(SNP)和多核苷酸修饰，使得THCAS和/或CBDAS多核苷酸的表达减少或受影响。21.根据权利要求1
‑
20中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述核苷酸修饰是错义突变、无义突变、插入、缺失、插入缺失、置换或重复。22.根据权利要求21所述的大麻植物或其细胞，其中所述插入或所述缺失产生包含移码的基因。23.根据权利要求1
‑
22中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述核苷酸修饰是沉默突变、敲低突变、敲除突变、功能丧失突变或造成增强的等位基因表达的突变。24.根据权利要求1
‑
23中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述植物对于所述至少一个核苷酸修饰而言是杂合的或纯合的。25.根据权利要求1
‑
24中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述靶向核苷酸修饰靶向至少一个THCAS和/或CBDAS多核苷酸等位基因的基因组基因座，使得所述一个或多个核苷酸修饰存在于编码THCAS和/或CBDAS酶的内源性多核苷酸的以下区域内：(a)编码区；(b)非编码区；(c)调节序列；或(d)非翻译区。26.根据权利要求1
‑
25中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述至少一个靶向核苷酸修饰产生以下一种或多种：a.所述THCAS和/或CBDAS多核苷酸的表达的降低或升高；b.由所述THCAS和/或CBDAS多核苷酸编码的蛋白的酶活性的降低或升高；c.所述THCAS和/或CBDAS多核苷酸的一种或多种非功能性可变剪接转录物的产生；d.所述THCAS和/或CBDAS多核苷酸的大部分或全长开放读码框的缺失；e.在控制所述THCAS和/或CBDAS多核苷酸的表达的调节区内存在的增强子基序的抑制或增强；f.在控制所述THCAS和/或CBDAS多核苷酸的表达的调节区内存在的阻遏物基序的抑制或增强；g.可操作地连接至所述THCAS和/或CBDAS等位基因多核苷酸的表达的调节元件的一个或多个核苷酸修饰或缺失，其中所述调节元件存在于启动子、内含子、3
’
UTR、终止子或它们
的组合内。27.根据权利要求1
‑
26中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中通过基因组修饰技术引入所述靶向DNA修饰，所述基因组修饰技术选自由以下成员组成的集合：多核苷酸指导的内切核酸酶、CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)和CRISPR相关的(Cas)(CRISPR
‑
Cas)内切核酸酶、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、工程化的位点特异性大范围核酸酶、Argonaute或它们的任何组合。28.根据权利要求27所述的大麻植物或其细胞，其中所述Cas基因或蛋白选自由以下成员组成的集合：Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cast10d、Cas12、Cas13、Cas14、CasX、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(或CasA)、Cse2(或CasB)、Cse3(或CasE)、Cse4(或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn1、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Cpf1、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cu1966、细菌噬菌体Cas诸如CasΦ(Cas
‑
phi)和它们的任何组合。29.根据权利要求1
‑
28中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述植物具有按重量计至多30％的THCA(和/或THC)和/或CBDA(和/或CBD)含量，具体地在按重量计约0％至约30％之间，更具体地在约0.3％至约30％之间，甚至更具体地在按重量计约0.1％至约10％之间。30.根据权利要求1
‑
29中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述植物具有按重量计不超过约0.3％的THCA(和/或THC)和/或CBDA(和/或CBD)含量。31.根据权利要求1
‑
30中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述植物具有按重量计至少20％的THCA(和/或THC)和/或CBDA(和/或CBD)含量。32.根据权利要求1
‑
30中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述植物不含THCA(或THC)和/或CBDA(或CBD)。33.根据权利要求1
‑
32中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述植物是杂种或近交系。34.根据权利要求1
‑
33中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述核苷酸修饰通过引入构建体而在植物中产生，所述构建体包含(a)CasDNA和与特定核苷酸序列具有至少80％序列相似性的gRNA序列，所述特定核苷酸序列选自由以下成员组成的集合：SEQ ID NO:7
‑
SEQ ID NO:1149和它们的任何组合；或(b)核糖核蛋白(RNP)复合物，其包含Cas蛋白和与特定核苷酸序列具有至少80％序列相似性的gRNA序列，所述特定核苷酸序列选自由以下成员组成的集合：SEQ ID NO:7
‑
1149和它们的任何组合。35.根据权利要求1
‑
34中的任一项所述的大麻植物或其细胞，其中所述植物在特定多核苷酸中包含至少一个靶向基因组修饰，所述特定多核苷酸选自由以下成员组成的集合：与在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列具有至少70％序列相似性的pFNTHCAS
‑
1、与在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列具有至少70％序列相似性的pFNTHCAS
‑
2、与在SEQ ID NO:3中所示的核苷酸序列具有至少70％序列相似性的pPKTHCAS
‑
1、包含与在SEQ IDNO:4中所示的核苷酸序列具有至少70％序列相似性的核酸序列的pPKTHCAS
‑
2、与在SEQ ID NO:5中所示的核苷酸序列具有至少70％序列相似性的pPKTHCAS
‑
3、与在SEQ ID NO:6中所示的核苷酸序列具有至少70％序列相似性的pPKTHCAS
‑
4、与在SEQ ID NO:1150中所示的核苷酸序列具
有至少70％序列相似性的pCBDAS2、与在SEQ ID NO:1151中所示的核苷酸序列具有至少70％序列相似性的pFNCBDAS、与在SEQ ID NO:1152中所示的核苷酸序列具有至少70％序列相似性的pPKCBDAS、与在SEQ ID NO:1153中所示的核苷酸序列具有至少70％序列相似性的pPKCBDAS1和它们的任何组合，并且与缺乏所述靶向基因组修饰的具有类似基因型或遗传背景的大麻植物相比，所述植物表现出减少的THCA、THC、CBDA和/或CBD的表达。36.一种重组DNA构建体，其包含编码RNA指导的内切核酸酶和至少一种指导RNA(gRNA)的多核苷酸序列，所述gRNA具有与调节区内的靶序列互补的序列，所述调节区可操作地连接至至少一个四氢大麻酚酸合酶(THCAS)和/或大麻二酚酸合酶(CBDAS)等位基因的表达。37.根据权利要求36所述的重组DNA构建体，其中所述gRNA序列包含与以下中的至少一个互补的多核苷酸序列：与在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列具有至少70％序列相似性的pFNTHCAS
‑
1、与在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列具有至少70％序列相似性的pFNTHCAS
‑
2、与在SEQ IDNO:3中所示的核苷酸序列具有至少70％序列相似性的pPKTHCAS
‑
1、包含与在SEQ ID NO:4中所示的核苷酸序列具有至少70％序列相似性的核酸序列的pPKTHCAS
‑
2、与在SEQ ID NO:5中所示的核苷酸序列具有至少70％序列相似性的pPKTHCAS
‑
3、与在SEQ ID NO:6中所示的核苷酸序列具有至少70％序列相似性的pPKTHCAS
‑
4、与在SEQ ID NO:1150中所示的核苷酸序列具有至少70％序列相似性的pCBDAS2、与在SEQ ID NO:1151中所示的核苷酸序列具有至少70％序列相似性的pFNCBDAS、与在SEQ ID NO:1152中所示的核苷酸序列具有至少70％序列相似性的pPKCBDAS、与在SEQ ID NO:1153中所示的核苷酸序列具有至少70％序列相似性的pPKCBDAS1。38.根据权利要求36
‑
37中的任一项所述的重组DNA构建体，其中所述gRNA序列包含与特定核苷酸序列具有至少80％序列相似性的多核苷酸序列，所述特定核苷酸序列选自SEQ ID NO:7
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：优良种子有限责任公司，
类型：发明
国别省市：