一种适用于大规模生产的低成本交联化琼脂糖微球的制备方法技术

本发明专利技术属于生物化学领域，公开了一种适用于大规模生产的低成本交联化琼脂糖微球的制备方法。该方法采用乳化搅拌法，将琼脂糖水溶液倒入含有乳化剂的油相中，在油包水体系中乳化成微球，通过涡轮搅拌桨的强剪切力作用以及混合乳化剂HLB调控的共同作用，选择合适的油相，形成的微球粒径几乎分布在45～160μm之间，相比于其它采取机械搅拌法的研究，大大减少了油相和乳化剂的加入量，具有巨大的工业前景。该方法操作简单，便于放大，适用于各类蛋白质、酶以及多肽的分离纯化。酶以及多肽的分离纯化。酶以及多肽的分离纯化。

【技术实现步骤摘要】
一种适用于大规模生产的低成本交联化琼脂糖微球的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物化学领域，具体涉及一种适用于大规模生产的低成本交联化琼脂糖微球的制备方法。

技术介绍

[0002]随着基因工程、蛋白质工程以及细胞工程等生命科学领域的不断发展、进步和突破，各类具有高价值的蛋白质、多肽、氨基酸、酶、激素、核酸等大分子不断涌现，它们在医疗保健、食品、农业、环境等领域发挥了重要作用。与此同时，生物大分子的分离和纯化给生物工程领域带来了巨大的挑战。目前生物大分子分离领域的主要手段是层析技术，其具有分离效率高、条件温和、适用性广、过程易于放大以及易于自动化的特点。层析介质的机械强度和蛋白质载量一直以来都是层析技术所亟需解决的关键问题，随着生物技术的不断发展，疫苗、病毒等活性大分子的出现，如何更快速、高效地实现这些物质的分离纯化，都对层析介质提出了更高的要求。
[0003]琼脂糖是多糖类层析分离介质中应用最广的一种，一般制成凝胶微球使用。琼脂糖具有良好的亲水性和生物相容性，用于生物领域的分离纯化工艺大都在水环境下进行，琼脂糖凝胶的亲水性和高度含水率使其应用时大大减少了对生物制品的破坏，生物相容性好也使其在医药领域广受欢迎。另外琼脂糖形成凝胶微球时的空间网状结构，孔径分布适中，因此琼脂糖凝胶微球不经过任何修饰就可以作为凝胶筛分的介质使用。再者，琼脂糖分子上数目众多的羟基可以使其容易被改性衍生，连接上高密度的活性基团，大大扩展了琼脂糖凝胶微球的使用范围。目前针对琼脂糖凝胶修饰的研究及产品都很多，像常见的蛋白纯化用阴离子和阳离子交换吸附剂、疏水吸附剂、亲和吸附剂和反相吸附剂等。琼脂糖介质除应用于凝胶过滤层析外,其偶联不同活性基团得到的改性产物也已广泛应用于离子交换、疏水以及各种通用与特异性生物亲和等层析技术中。琼脂糖凝胶介质本身的一系列优点使得它在酶、蛋白质、多肤、核酸等生物大分子的分离纯化中起重要作用。
[0004]根据现有的研究报道，琼脂糖层析介质多以45～160μm微球为主，而多种琼脂糖微球的制备方法中仅机械搅拌法应用于琼脂糖微球的工业化大生产。目前以机械搅拌法制备的琼脂糖微球普遍存在粒径不均一、尺寸难以控制等问题，同时油相用量几乎在水相用量的3倍以上，往往乳化剂的用量也占据了油相重量的4％以上，成本较高。专利CN105713212A报道了以机械搅拌法制备交联琼脂糖微球，乳化过程水相和油相体积比例为1:(6～7)，乳化剂重量占油相重量的1.8～2.5％；专利CN114957736A乳化过程水相和油相重量比例为1:2，乳化剂重量占油相重量的5～10％。基于上述考虑，着重优化琼脂糖微球的制备条件，调控介质合成的工艺参数，是在工业化生产中降低琼脂糖微球制备成本的关键所在。

技术实现思路

[0005]针对本领域目前机械搅拌法制备琼脂糖微球普遍存在粒径不均一、尺寸难以控
制、油相和乳化剂使用量大等问题，本专利技术提供了一种适用于大规模生产的低成本交联化琼脂糖微球的制备方法。该方法通过涡轮搅拌桨的强剪切力作用以及对乳化剂HLB调控的共同作用，可对琼脂糖微球尺寸进行精准调控，高速搅拌带来的高剪切力能将琼脂糖水溶液剪切成尺寸更小更均匀的微球，降低了油相和乳化剂使用量。因此，该法尤其适用于大规模生产琼脂糖微球，具有良好的工业前景。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
[0007]i)水相制备
[0008]将琼脂糖粉分散于去离子水中，搅拌加热至90℃以上，直至琼脂糖完全溶解，加入少量无机盐；
[0009]ii)乳化
[0010]将i)得到的琼脂糖溶液趁热加至含特定HLB值乳化剂的油相中60～80℃乳化，乳化过程采用涡轮搅拌桨进行搅拌，过程中取样至激光粒度仪测定粒径，大部分微球粒径在200μm以下后停止乳化，降温至20℃以下析出固体微球；
[0011]iii)交联反应
[0012]将得到的微球分散在去离子水和丙酮中，室温下滴加含NaBH4的质量浓度为30～50％NaOH溶液，并滴加双官能团交联剂，控制滴加时间，滴加完成后在35～55℃下交联反应，洗净后得到最终的产品。
[0013]进一步，步骤i中琼脂糖在去离子水中的质量分数为2～10％，优选为3～6％。
[0014]进一步，步骤i中去离子水与步骤ii中油相重量比例为1:(0.8～1.5)，优选为1:1。
[0015]进一步，步骤i中所述的无机盐为氯化钠、氯化钙、氯化镁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸钠、硫酸镁中的一种。
[0016]进一步，步骤ii中的油相可以为甲苯、液体石蜡、环己烷中的一种，优选为甲苯。
[0017]进一步，步骤ii中的乳化剂可以为可为单一或复配乳化剂，乳化剂的HLB值需在5～8之间，重量为油相重量的0.3～1％。优选为HLB值6～7，重量分数0.6％。
[0018]进一步，步骤iii中双官能团交联剂可以为环氧氯丙烷、1,4
‑
丁二醇双缩水甘油醚、2,3
‑
二溴丙醇中的一种。
[0019]进一步，步骤iii中交联升温反应时间为12～24h,优选为20h。
[0020]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：(1)通过混合乳化剂并改变两者的比例有利于精准调控乳化剂的HLB值，从而达到精准调控琼脂糖微球粒径的目的；(2)采用了涡轮搅拌的搅拌方式，与其它搅拌桨相比具有更高的剪切力和更高的线速度，在相同转速下能将琼脂糖水溶液被剪切成尺寸更小更均匀的微球，降低了油相和乳化剂的用量。同时在相同转速下，涡轮搅拌范围增大，搅拌桨的线速度提升是十分明显的，因此，该搅拌桨尤其适用于工业化大生产。(3)该法操作简单，便于放大。通过上述两种方法并行，大大降低了油相和乳化剂的用量。因此，该法用在工业化生产中是具有实际意义的。
附图说明
[0021]图1为实施例1得到的交联琼脂糖微球显微镜物镜4X下微球照片；
[0022]图2为实施例1得到的交联琼脂糖微球显微镜物镜40X下微球照片；
[0023]图3为激光粒度仪测定的实施例1微球粒径分布图；
[0024]图4为实施例5得到的交联琼脂糖微球与同类型商品化交联琼脂糖微球压力流速曲线图。
[0025]图5为对比例1得到的琼脂糖微球显微镜物镜4X下微球照片；
[0026]图6为对比例2得到的琼脂糖微球显微镜物镜4X下微球照片；
[0027]图7为对比例3得到的琼脂糖微球显微镜物镜4X下微球照片。
具体实施方式
[0028]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本领域技术人员在理解本专利技术的技术方案基础上进行修改或等同替换，而未脱离本专利技术技术方案的精神和范围，均应涵盖在本专利技术的保护范围内。以下具体实施方式中所采用的原料均购于市场。
[0029]除非特殊说明，室温表示为25℃。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于大规模生产的低成本交联化琼脂糖微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：i)水相制备将琼脂糖粉分散于去离子水中，搅拌加热至90℃以上，直至琼脂糖完全溶解，加入少量无机盐；ii)乳化将i)得到琼脂糖溶液趁热加至含特定HLB值乳化剂的油相中60～80℃乳化，乳化过程采用涡轮搅拌桨进行搅拌，过程中取样至激光粒度仪测定粒径，大部分微球粒径在200μm以下后停止乳化，立即降温至20℃以下析出固体微球；iii)交联反应将得到的微球分散在去离子水和丙酮中，室温下加入含NaBH4的质量浓度为30～50％NaOH溶液，并滴加双官能团交联剂，控制滴加时间，滴加完成后在35～55℃下交联反应，洗净后得到最终的产品。2.根据权利要求1所述的适用于大规模生产的低成本交联化琼脂糖微球的制备方法，其特征在于：步骤i中琼脂糖在去离子水中的质量分数为2～10％。3.根据权利要求1所述的适用于大规模生产的低成本交联化琼脂糖微球的制备方法，其特征在于：步骤i中所述的无机盐为氯化钠、氯化钙、氯化镁、磷酸氢二钠、磷...

【专利技术属性】
技术研发人员：金子杰，米静，
申请(专利权)人：苏州净汉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：