一种沙门氏菌新型核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法技术

本发明专利技术公开了一种沙门氏菌新型核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法，所述试剂盒包括反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、甜菜碱、石墨化碳纳米管、聚乙二醇甲醚、SYBR Green I、检测引物，所述检测引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。与传统检测试剂盒和方法相比，本发明专利技术方法具有简便快捷、特异性强、灵敏度高、重复性好的优点，在检测效率与检测成本方面均明显优于现行国标检测方法，适合于批量检测。适合于批量检测。适合于批量检测。

【技术实现步骤摘要】
一种沙门氏菌新型核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法


[0001]本专利技术属于分子生物学检测
，具体涉及一种沙门氏菌核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法。

技术介绍

[0002]沙门氏菌(Salmonella)是肠杆菌科中最常见的人畜共患病原菌，常寄生于动物和人体肠道内，最早由美国兽医专家Daniel Salmon于1885年首次分离。不论发达国家还是发展中国家，沙门氏菌都是导致人类感染的重要食源性细菌。由沙门氏菌引起的食物中毒是所有细菌性食物中毒中比例最高，危害最广的一种，约占细菌性食物中毒的42.6％
‑
60％。据世界卫生组织估计，每年约有135万人感染沙门氏菌，主要是由于食物污染造成的。沙门氏菌最易传播的来源是，切块的水果，不干净的蔬菜和生食，特别是各种生肉和生鸡蛋是重要的传染源。根据国际惯例，要求对易受沙门氏菌污染的食品进行分类管理，以使大多数食物不含沙门氏菌，从而有效预防沙门氏菌病。
[0003]目前国内外对于沙门氏菌的检测标准都是基于传统培养结合血清学分型的方法(如GB/T 4789.4
‑
2008，SN 0170
‑
92，AOAC 967.25
‑
967.28，ISO 6579:2002/Amd 1:2007等)，由于上述方法包括前处理、预增菌、选择性增菌、选择性培养、生化鉴定和血清学测试等，过程非常繁琐且费时(5～7天)，不能达到及时发现病原、控制传播途经，消除污染源的疫病防控要求。随着科技的发展，以PCR、LAMP等分子生物学方法在沙门氏菌的快速检测中得到逐步应用，但上述方法仍存在诸多缺陷。例如，PCR方法灵敏度相对偏低，检测时间也相对偏长，且为提高检出率通常需要增菌后检测；LAMP方法虽灵敏度大幅提高，检测时间也缩短，但极易发生气溶胶污染，且因引物较多易造成引物二聚体，无法通过琼脂糖凝胶电泳辨别假阳性结果。
[0004]基于上述原因，本专利技术提供一种新型的沙门氏菌核酸检测方法，可有效解决传统PCR和LAMP检测中的缺陷，仅使用一对引物，就可以达到简便快捷、特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对细菌学检测与传统核酸检测技术在沙门氏菌检测中存在的不足，特别是如何提高检测效率、灵敏度与特异性，提供了一种特异性检测沙门氏菌的新型核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法。
[0006]本专利技术技术方案如下：
[0007]本专利技术提供了一种特异性检测沙门氏菌的新型核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法，所述沙门氏菌的核酸检测试剂盒包括10
×
反应缓冲液、8000U/μl Bst DNA聚合酶、10mM dNTPs、检测引物、甜菜碱、石墨化碳纳米管、聚乙二醇甲醚、阳性对照和阴性对照；所述检测引物为SEQ ID NO.1的引物和SEQ ID NO.2的引物的组合。
[0008]本专利技术通过使用特别设计的一对检测引物，就可以实现特异性强、灵敏度高的优
点。特别需要说明的是，本专利技术的试剂盒加入石墨化碳纳米管后的扩增条带，有单一的目的特异性条带(如图1所示)。本专利技术设计是在链交换扩增(使用一对引物进行等温扩增)的基础上改进的(仍使用一对引物，分两步进行扩增)。研究发现，在不加入石墨化碳纳米管的情况下，会出现类似链交换扩增的非特异性扩增现象(如图1所示，出现引物二聚体而特异性条带不清晰等)，所以通过加入石墨化碳纳米管等新型纳米材料可以最大限度的提高反应特异性。石墨化碳纳米管对基因扩增的机制不明，据推测由于表面电荷性质，可与单链DNA形成相对稳定的结构，而双链DNA由于双链间氢健作用力更稳定，所以不会石墨化碳纳米管结合。因此，石墨化碳纳米管可以吸附多余未参加反应的引物单链，以防止引物二聚体的产生，有效提高反应特异性。
[0009]本专利技术的试剂盒中加入甜菜碱可帮助DNA聚合酶顺利通过DNA某些复杂二级结构，防止DNA聚合酶从模板DNA中解离。DNA局部区域因含有多个复杂碱基(Py
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G
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C)，会促使DNA聚合酶的停滞，最终导致DNA聚合酶停止有效延伸。而甜菜碱可提高DNA小沟中富含鸟嘌呤和胞嘧啶区域的鸟嘌呤和胞嘧啶的水合作用，影响DNA分子结构，改变DNA灵活性，帮助DNA聚合酶沿着DNA模板延伸。其次，甜菜碱可消除变性温度对碱基的依赖性。浓度依赖性降低高GC含量序列的Tm，并使不同引物的Tm相接近，最终降低DNATm值。此外，甜菜碱溶液可稳定DNA
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蛋白复合物。
[0010]进一步的，所述阳性对照为沙门氏菌ATCC14028基因组DNA，所述阴性对照为无菌生理盐水
[0011]进一步的，所述沙门氏菌试剂盒检测体系的组分为：每25μL反应液中包括10
×
反应缓冲液2.5μL，Bst DNA聚合酶1μL，dNTPs 3.5μL，10
×
SYBR Green I 2.5μL，甜菜碱(10mM)1.2μL，聚乙二醇甲醚0.8μL，石墨化碳纳米管溶液(10ng/μL)1.5μL，SAL
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F和SAL
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R各1.5μL，待检样品DNA 3μL，其余为灭菌生理盐水。
[0012]进一步的，所述沙门氏菌检测方法的反应流程为：74℃1秒，60℃1秒，循环总数45。
[0013]进一步的，所述10
×
反应缓冲液含有200mM Tris
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HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％TritonX
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100，pH 8.0～8.8。
[0014]进一步的，所述沙门氏菌检测方法的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
[0015]进一步的，所述dNTPs包括dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM。
[0016]更进一步的，一种使用沙门氏菌检测试剂盒进行非诊断性检测的方法，包括以下步骤：
[0017]S1：使用煮沸法或商品化试剂盒提取细菌基因组DNA，得到检测模板。
[0018]S2：扩增反应，将10
×
反应缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶、检测引物以及DNA模板加入灭菌反应管中，添加灭菌生理盐水至总体积25μl，同时设置阳性、阴性对照，使用荧光定量PCR仪进行扩增反应；采用3％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行电泳检测并分析结果。
[0019]相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0020]本专利技术根据比较基因组学筛选的沙门氏菌特异基因序列设计引物，具有灵敏度高，特异性强的优点。同时，本专利技术只需通过一次反应，即可对沙门氏菌进行快速检测，相比传统的细菌学结合血清学分型的检测方法，在检测时间与检测成本方面具有较大优势，适合于批量检测。
附图说明
[0021]图1为实施例1中琼脂糖凝胶电泳检测结果。图中：M为Takara本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种沙门氏菌新型核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：1)反应缓冲液；2)检测引物：正向引物SAL
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F和反向引物SAL
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R，所述的SAL
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F和SAL
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R引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；3)Bst DNA聚合酶；4)dNTPs；5)SYBR Green I；6)甜菜碱；7)聚乙二醇甲醚；8)石墨化碳纳米管。2.根据权利要求1所述的多杀性巴氏杆菌新型核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：9)阳性对照：沙门氏菌ATCC14028基因组DNA；10)阴性对照：灭菌生理盐水。3.根据权利要求1所述的沙门氏菌新型核酸检测试剂盒，其特征在于,所述的反应缓冲液含有Tris
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HCl、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁和Triton X
‑
100。4.根据权利要求1所述的一种沙门氏菌新型核酸检测试剂盒，其特征在于,正向引物SAL
‑
F和反向引物SAL
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R的浓度均为10pmol/μL。5.根据权利要求1所述的一种沙门氏菌新型核酸检测试剂盒，其特征在于,该试剂盒的检测反应体系为：每25μL反应液中包括10
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【专利技术属性】
技术研发人员：龚建森，张笛，盛中伟，董永毅，沈海玉，韩先干，吴坤，苗晋锋，徐步，窦新红，
申请(专利权)人：江苏省家禽科学研究所，
类型：发明
国别省市：