一种草菇纤维二糖水解酶及其用途制造技术

本发明专利技术提供了一种低温草菇纤维二糖水解酶，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术还提供了上述的草菇纤维二糖水解酶作为添加物在提高水稻秸秆低温青贮加工效率中的应用。本发明专利技术还提供了一种提高水稻秸秆低温青贮加工效率的方法，利用上述的草菇纤维二糖水解酶进行遗传转化，提取转化子的粗纤维素酶复合物，然后与植物乳杆菌混合添加到稻草秸秆进行低温青贮加工。本发明专利技术的方法解决了东北等寒冷地区低温不利于纤维素酶活力，进而影响高效生产青贮饲料的问题。贮饲料的问题。贮饲料的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种草菇纤维二糖水解酶及其用途


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种新型草菇纤维二糖水解酶，具体来说是一种草菇纤维二糖水解酶及其用途。

技术介绍

[0002]秸秆是农业生产的常见副产品。根据食物和农业组织，全球谷物秸秆年产量达到大约20亿吨(Aquino et al.,Sustainable rice straw management,2020)。其中作为中国最重要的粮食产区，仅东北地区就每年生产秸秆超过2亿吨(Fu etal.,Remote Sens,2020)。因此，全面秸秆废弃物的资源化利用是环境保护和可持续农业的重大挑战。
[0003]青贮是一种基于厌氧乳酸发酵的草料保存策略，能够有效的规避季节性带来的稻草副产品利用问题(Cai et al.，J Clean Prod,2021)。适宜的温度和充足的碳氮原料是成功生产青贮饲料的先决条件。但这种生产需要利用乳杆菌和纤维素酶的外源添加才能高效生产青贮饲料。而大部分纤维素酶的优化温度是超过25℃，因此秸秆青贮在寒冷地区的应用是一项挑战。特别是在中国东北，那里的水稻收割是在冬季(10月)进行的，这不利于正常青贮加工。筛选在低温下保持高活性纤维素酶是一种很有前途的有效青贮策略。
[0004]草菇(Volvariella volvacea)被称为“中国菇”，是一种重要的食用菌。草菇菌丝的生长和结实要求比较高的温度(28
–
35℃)，尤其是其菌丝和子实体不耐低温，即使在常规低温4℃下，菌丝和子实体在短时间内便会软化、液化甚至腐烂，即通常所说的“低温自溶”。这种高温食用菌有一套在低温下保持高表达纤维素酶系统(Gong et al.,Postharvest Biology and Technology,2022)(Gong等人，2022)。然而，迄今为止，这组酶系统在菌丝生长或子实体期表现出非常低的表达水平，缺乏功能特征或应用的研究。这为进一步纤维素酶耐低温适应性功能验证及应用提供了大规模可供挖掘的新型的酶资源。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种草菇纤维二糖水解酶及其用途，所述的这种草菇纤维二糖水解酶及其用途要解决现有技术中的水稻秸秆低温青贮加工效率低的技术问题。
[0006]本专利技术提供了一种低温草菇纤维二糖水解酶，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]本专利技术还提供了上述的草菇纤维二糖水解酶作为添加物在提高水稻秸秆低温青贮加工效率中的应用。
[0008]具体的，所述的低温是指温度指小于或等于10℃。
[0009]进一步的，所述的应用，是利用草菇纤维二糖水解酶进行遗传转化提取转化子的粗纤维素酶复合物，然后与植物乳杆菌混合添加到稻草秸秆进行低温青贮加工。
[0010]本专利技术还提供了一种提高水稻秸秆低温青贮加工效率的方法，利用上述的草菇纤维二糖水解酶进行遗传转化，提取转化子的粗纤维素酶复合物，然后与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)混合添加到稻草秸秆进行低温青贮加工。
[0011]具体的，所述的一种提高水稻秸秆低温青贮加工效率的方法包括如下步骤：
[0012]1)采用上述的草菇纤维二糖水解酶序列，然后通过农杆菌介导的里氏木霉遗传转化获得草菇纤维二糖水解酶转化菌株；
[0013]2)提取草菇纤维二糖水解酶转化菌株的粗纤维素酶复合物；
[0014]3)将草菇纤维二糖水解酶转化菌株的粗纤维素酶复合物和植物乳杆菌混合添加到稻草，进行水稻秸秆低温青贮加工。
[0015]本专利技术的方法解决了东北等寒冷地区低温不利于纤维素酶活力，进而影响高效生产青贮饲料的问题。
[0016]本专利技术的验证利用草菇纤维二糖水解酶作为添加物提高水稻秸秆低温青贮加工效率的方法的步骤如下：
[0017]1)基于草菇基因组数据库的注释信息，获取草菇纤维二糖水解酶VvCBHI
‑
I序列，然后通过农杆菌介导的里氏木霉(Trichoderma reesei)遗传转化获得VvCBHI
‑
I转化菌株；
[0018]2)提取转化菌株的粗纤维素酶复合物，使用滤纸做底物，然后进行不同温度下总纤维素酶活性的测定；
[0019]3)将草菇纤维二糖水解酶VvCBHI
‑
I进行异源蛋白表达，提取粗纤维素酶复合物，使用PRS做底物，然后进行不同温度下糖化水解能力的测定；
[0020]4)将草菇纤维二糖水解酶VvCBHI
‑
I进行异源蛋白表达，提取粗纤维素酶复合物，和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)混合添加到稻草，然后开展稻草低温青贮实验，评价VvCBHI
‑
I粗纤维素酶复合物作为添加物在提高水稻秸秆低温青贮加工的效率。
[0021]本专利技术和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本专利技术利用草菇VvCBHI
‑
I的低温糖化水解能力提高稻草秸秆低温青贮加工效率的方法，本专利技术具有以下优点：
[0022](1)从草菇VvCBHI
‑
I异源表达的转化菌株提取的粗纤维素酶复合物，在10
‑
30℃保持较高的纤维素酶活性。
[0023](2)利用草菇VvCBHI
‑
I的低温糖化水解能力，显著提高稻草秸秆低温青贮加工效率。
[0024](3)证实了草菇具有一个冷适应性纤维素酶的新型资源库。
附图说明
[0025]图1VvCBHII的里氏木霉(Trichoderma reesei)转化子和野生型T.reesei提取的粗纤维素酶复合物的滤纸酶活的最优温度。T1：VvCBHI
‑
I的T.reesei转化子；Rut
‑
C30为野生型T.reesei。
[0026]图2不同温度下野生型Rut
‑
C30及其转化子T1提取的粗酶制剂水解PRS形成还原糖的产量。
[0027]图3加入纯化蛋白的野生型Rut
‑
C30的粗酶制剂水解PRS形成还原糖的产量。Rut
‑
C30:Rut
‑
C30的粗纤维素酶复合物。0.3
‑
vv和0.6
‑
vv:Rut
‑
C30粗纤维素酶复合物加上0.3或0.6mg纯化的VvCBHI
‑
I蛋白。0.3
‑
Tr和0.6
‑
Tr:Rut
‑
C30粗纤维素酶复合物加上0.3或0.6mg纯化的野生型Rut
‑
C30内源TrCBHI蛋白。每个误差条表示三次重复的标准差。
[0028]图4转化子T1提取的粗纤维素酶复合物与植物乳杆菌混合添加对低温水稻秸秆青贮的纤维素含量的影响。CK，无菌水；L，植物乳杆菌悬液；LC，植物乳杆菌和Rut
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种草菇纤维二糖水解酶，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述的草菇纤维二糖水解酶作为添加物在提高水稻秸秆低温青贮加工效率中的应用。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，是利用草菇纤维二糖水解酶进行遗传转化提取转化子的粗纤维素酶复合物，然后与植物乳杆菌混合添加到稻草秸秆进行低温青贮加工。4.一种提高水稻秸秆低温青贮加工效率的方法，其特征在于：利用权利要求1所述的草菇纤维二糖水解酶进行遗传转化，提取转化子...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹根，龚明，汪滢，陈洪雨，鲍大鹏，尚俊军，李燕，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：