一种检测粪肥源耐药细菌在农田植株中传播的方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种检测粪肥源耐药细菌在农田植株中传播的方法及其应用，属于环境微生物检测技术领域。本发明专利技术通过对不同施肥处理方式下农田生长的植株样品进行DNA提取，并进行高通量定量PCR及高通量测序等，从而测定样品中ARGs和细菌的多样性和相对丰度，分析由粪肥引入到施肥农田蔬菜中的潜在耐药细菌种类，在施用粪肥前和农业管理过程中，应采取有效措施减少或避免引入潜在的耐药细菌，以保护农产品安全和公众健康，因此具有良好的实际应用之价值。值。值。

【技术实现步骤摘要】
一种检测粪肥源耐药细菌在农田植株中传播的方法及其应用


[0001]本专利技术属于环境微生物检测
，具体涉及一种检测粪肥源耐药细菌在农田植株中传播的方法及其应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]抗生素抗性基因(ARGs)是一类新兴的环境污染物，对全球人类健康构成潜在威胁。施用畜禽粪肥和堆肥会使土壤中的ARGs水平显著增高。牛粪及其堆肥常常作为改善农田土壤营养物质的肥料，其中可能含有大量的抗生素残留、ARGs和可移动遗传元件(MGEs)，不仅导致施肥土壤中外源抗性基因的引入和增加其传播风险，还会使其通过抗生素选择性压力间接促进土著抗性菌的富集。
[0004]施肥土壤中的ARGs可能迁移进入蔬菜等农作物中，当人们食用未加工或简单加工的生菜、萝卜、黄瓜等蔬菜时，ARGs可进一步通过食物链转移进人体，从而对人类健康构成潜在危害。一些粪肥来源的ARGs可在农田土壤中存活较长的时间，且由于土壤微生物群落可作为植物微生物组的源，通过根际、叶际向植株内部组织迁移，因此施用畜禽粪肥/堆肥不仅可直接导致土壤抗性微生物的增加，还可能通过地下和地上的联系而导致地上部分可食植株中抗性微生物增加，进而对农产品安全和公众健康构成潜在威胁。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的不足，本专利技术提供一种检测粪肥源耐药细菌在农田植株中传播的方法及其应用。本专利技术通过对不同施肥处理方式下农田生长的植株样品进行DNA提取，并进行高通量定量PCR及高通量测序等，从而测定样品中ARGs和细菌的多样性和相对丰度，进而分析潜在的耐药细菌及其在农田生态系统的传播途径，从而为科学施用粪肥和堆肥提供依据，因此具有良好的实际应用之价值。
[0006]具体的，本专利技术涉及以下技术方案：
[0007]本专利技术的第一个方面，提供一种检测粪肥源耐药细菌在农田植株中传播的方法，所述方法包括：
[0008]对不同施肥处理条件下农田生长获得的植株样品进行DNA提取并进行检测分析，测定粪肥源耐药细菌以及它们携带的ARGs和/或MGEs。
[0009]其中，不同施肥处理包括不施用有机肥处理以及施用有机肥(所述有机肥优选为粪肥)处理；所述粪肥可以为经过堆肥处理和未经堆肥处理的猪粪肥、鸡粪肥和牛粪肥。
[0010]所述植株可以为任意一种可以在农田中种植的植株，在本专利技术的一个具体实施方式中，所述植株为生菜。
[0011]所述植株样品可以是植株的根部或叶部，从而获得根际、叶际和叶内相关微生物
信息，进而用于检测分析ARGs在土壤及植株中的传播。
[0012]所述方法还包括：对有机肥进行DNA提取并检测分析，测定其中的耐药细菌以及它们携带的ARGs和/或MGEs；
[0013]采用双边网络分析来获取施肥向植株中转移的抗性基因种类，对植株中粪肥来源的ARGs和细菌属的相对丰度进行Spearman相关性分析，筛选极显著相关(R>0.7,P<0.01)的细菌属，作为有机肥处理向植株中引入的潜在的耐药细菌种类。
[0014]粪肥(包括牛粪和牛粪堆肥)源引入植株的耐药细菌包括但不限于Euzebya、Halomonas、Luteimonas、Nannocystis、Haliangium、Achromobacter、Virgibacillus、Caldilinea、Glycomyces、Thermobispora、Saccharomonospora、Thermobifida、Actinomadur和Glycomyces；携带的ARGs是tnpA
‑
04和/或sul2；
[0015]更具体的，由牛粪堆肥引入到生菜中的耐药细菌属主要包括：携带aadA
‑
01的Virgibacillus和Achromobacter，携带blaCTX
‑
M
‑
02的Planifilum、Tepidimicrobium、Desulfotomaculum和Haliangium，以及携带tnpA
‑
04的Thermobifida、Saccharomonospora、Thermobispora、Glycomyces、Nannocystis、Halomonas和Luteimonas。
[0016]本专利技术的第二个方面，提供上述检测粪肥源耐药细菌在农田植株中传播的方法在农业管理中的应用。
[0017]上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
[0018]上述技术方案提供一种检测粪肥源耐药细菌在农田植株中传播的方法，通过对不同施肥处理方式下农田生长的植株样品进行DNA提取，并进行高通量定量PCR及高通量测序等，从而测定样品中ARGs和细菌的多样性和相对丰度，分析由粪肥引入到施肥农田蔬菜中的潜在耐药细菌种类，在施用粪肥前和农业管理过程中，应采取有效措施减少或避免引入潜在的耐药细菌，以保护农产品安全和公众健康，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
[0019]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0020]图1为本专利技术实施例1中双边网络分析揭示在牛粪、对照组生菜和施加牛粪处理的生菜中共有和特有的ARGs的示意图，不同颜色的节点代表不同抗生素抗性类型的ARGs，椭圆内的表示可能由牛粪转移进入生菜的ARGs；
[0021]图2为本专利技术实施例1中双边网络分析揭示在牛粪堆肥、对照组生菜和施加牛粪堆肥处理的生菜中共有和特有的ARGs的示意图，不同颜色的节点代表不同抗生素抗性类型的ARGs，椭圆内的表示可能由牛粪堆肥转移进入生菜的ARGs；
[0022]图3为本专利技术实施例1中双边网络分析展示来源于牛粪(a)和牛粪堆肥(b)的ARGs与细菌属的Spearman相关示意图，不同颜色的圆形节点代表不同抗生素抗性类型的ARGs，不同颜色的方形节点代表不同属的细菌，节点大小与连接度成正比，边的宽度和相关系数成正比。
具体实施方式
[0023]应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另
有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0024]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0025]结合具体实例对本专利技术作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测粪肥源耐药细菌在农田植株中传播的方法，其特征在于，所述方法包括：对不同施肥处理条件下农田生长获得的植株样品进行DNA提取并进行检测分析，测定粪肥源耐药细菌以及它们携带的抗生素抗性基因和/或可移动遗传元件。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，不同施肥处理包括不施用有机肥处理以及施用有机肥(所述有机肥优选为粪肥)处理。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述粪肥为经过堆肥处理和未经堆肥处理的猪粪肥、鸡粪肥和牛粪肥；优选的，所述粪肥包括直接风干粉碎的牛粪样品和牛粪堆肥样品。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植株为任意一种可以在农田中种植的植株；优选的，所述植株为生菜。优选的，所述植株样品是植株的根部或叶部，从而获得根际、叶际和叶内相关微生物信息，进而用于检测分析抗生素抗性基因在土壤及植株中的传播。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：对有机肥进行DNA提取并检测分析，测定其中的耐药细菌以及它们携带的抗生素抗性基因和/或可移动遗传元件。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，使用扩增引物对341F：CCTAYGGGRBGCASCAG(SEQ ID NO.1)和806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT(SEQ ID NO.2)对上述待测样品中的16S rRNA基因的V3
‑
V4区进行扩增。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用高通量定量PCR技术测定待测样品中ARGs和MGEs的丰度和多样性；优选的，计算抗生素抗性基因(ARGs)和可移动遗传元件(MGEs)的相对丰度可使用公式2
‑
ΔCT
的方法进行；具体的，ΔCT＝(CT
目标ARGs
‑
CT
16S...

【专利技术属性】
技术研发人员：桑文才，韩雪梅，李金阳，王海霞，张明亮，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：