一种与心脏表面特异性结合的核酸适配体及制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种与心脏表面特异性结合的核酸适配体及其制备方法和应用，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术所述核酸适配体序列为SEQ IDNO：1所示的DNA序列，本发明专利技术还包括在本发明专利技术所述核酸适配体序列上经过修饰，删减、增加或置换碱基后得到的具有相同特异性识别功能的单链DNA分子。本发明专利技术所得核酸适配体具备较高特异性及亲和力。较高特异性及亲和力。较高特异性及亲和力。

【技术实现步骤摘要】
一种与心脏表面特异性结合的核酸适配体及制备方法和应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，尤其涉及一种与心脏表面特异性结合的核酸适配体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]核酸适配体(aptamer)是一种通过体外筛选技术(SELEX)获得的具有特殊结构和功能的核酸分子，能与目标物质高特异性、高选择性地结合。与传统的识别分子相比，核酸适配体具有亲和力高、特异性强、生物兼容性好、容易合成和修改等诸多优点，在生物医学和食品安全等领域得到了广泛的关注。特别是核酸适配体作为良好的药物靶向载体，在科研应用中较为广泛，但目前并不存在针对心脏表面的核酸适配体。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种与心脏表面特异性结合的核酸适配体，可以特异性结合心肌细胞。
[0004]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0005]本专利技术提供了一种与心脏表面特异性结合的核酸适配体，所述核酸适配体序列如SEQ ID NO：1所示。
[0006]优选的，所述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、氧甲基化、甲基化、氨基化、巯基化、氟化或同位素化。
[0007]优选的，所述核酸适配体的核苷酸序列上偶联有荧光基团、淬灭基团、生物素、纳米材料、巯基、氨基或酶。
[0008]本专利技术提供了一种与心脏表面特异性结合的核酸适配体，由上述核酸适配体进行核苷酸删减、增加或置换后获得的具有相同特异性识别功能的单链DNA分子。
[0009]本专利技术还提供了上述核酸适配体的筛选方法，以单链寡核苷酸片段为筛选材料，以H9C2细胞为正筛对象，以HUVEC细胞为负筛对象筛选得到。
[0010]优选的，所述单链寡核苷酸片段序列为SEQ ID NO：2。
[0011]本专利技术提供了一种与心脏表面特异性结合的核酸适配体衍生物，由上述核酸适配体进行氨基化、巯基化或同位素化修饰得到的与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物。
[0012]本专利技术还提供了上述核酸适配体或上述的核酸适配体衍生物在心脏靶向研究中的应用。
[0013]优选的，利用所述核酸适配体或所述核酸适配体衍生物制备心脏靶向药物载体。
[0014]本专利技术还提供了上述核酸适配体或上述的核酸适配体衍生物在制备心脏靶向药物中的应用。
[0015]本专利技术的有益效果：
[0016]本专利技术首次获得针对心脏表面的核酸适配体。本专利技术通过cell
‑
SELEX技术，流式
细胞术获取适配体候选，通过流式细胞术，共聚焦荧光显微镜等实验选取核酸适配体，再结合流式细胞术，共聚焦荧光显微镜实验验证所得核酸适配体具备较高特异性及亲和力，保证了所得核酸适配体的实用性。
附图说明
[0017]图1：PCR产物电泳图；
[0018]图2：流式细胞术监测筛选进程；
[0019]图3：测序结果示意图；
[0020]图4：三条序列H1～3(从左到右)分别与H9C2的结合情况；
[0021]图5：核酸适配体H3的二级结构示意图；
[0022]图6：H3分别在4℃(图左)和37℃(图右)Kd值分析；
[0023]图7：H3分别在4℃和37℃的共聚焦显微镜观察实验结果；
[0024]图8：不同细胞分别与适配体H3的结合情况；
[0025]图9：血清稳定性实验结果。
具体实施方式
[0026]本专利技术提供了一种与心脏表面特异性结合的核酸适配体，所述核酸适配体序列如SEQ ID NO：1所示，68个碱基，具体为5
’‑
CACGGATCCTGACAAGACACGATAATCTGTGTTGGACACAGTCTGTTG TCATGGGCCAGCTCCGTCCG
‑3’
。
[0027]本专利技术还提供了上述核酸适配体的筛选方法：以10OD的单链寡核苷酸片段文库为筛选材料，先与正筛选对象大鼠心肌细胞(H9C2)进行两轮的筛选及扩增，在尽可能避免能与靶标结合的ssDNA(目的片段)丢失的同时，保证了目的片段的丰度，使筛选结果尽可能可靠。再加入负筛选过程，使得筛选得到的ssDNA具有较好的特异性，且考虑到筛选结果可能的后续应用，负筛选对象定位人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)。
[0028]本专利技术所述单链寡核苷酸片段序列如SEQ ID NO：2所示，具体为5
′‑
CACGGATCCTGACAAG
‑
(N40)
‑
CAGCTCCGTCCG
‑3’
，为68个碱基，两端是28个碱基的固定引物结合区域，对应互补的引物序列，中间为40个碱基的随机区域，是与靶标结合的区域。
[0029]本专利技术所述核酸适配体还包括SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、氧甲基化、甲基化、氨基化、巯基化、氟化或同位素化得到的核酸适配体序列。优选为采用2
′‑
O
‑
甲基修饰。
[0030]本专利技术所述核酸适配体的核苷酸序列上还可以偶联有荧光基团、淬灭基团、生物素、纳米材料、巯基、氨基或酶。
[0031]本专利技术还提供了一种与心脏表面特异性结合的核酸适配体，由所述核酸适配体进行核苷酸删减、增加或置换后获得的具有相同特异性识别功能的单链DNA分子。
[0032]本专利技术还提供了与心脏表面特异性结合的核酸适配体衍生物，由本专利技术所述核酸适配体进行氨基化、巯基化或同位素化修饰得到的与本专利技术所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物。
[0033]本专利技术还提供了所述核酸适配体或核酸适配体衍生物在心脏靶向研究中的应用，优选为利用所述核酸适配体或所述核酸适配体衍生物制备心脏靶向药物载体。
[0034]本专利技术还提供了所述核酸适配体或核酸适配体衍生物在制备心脏靶向药物中的应用。
[0035]下面结合实施例对本专利技术提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。
[0036]下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037]实施例1
[0038]本实施例提供了核酸适配体的筛选方法：
[0039](1)从生工生物工程(上海)股份有限公司订购序列DL，FS，LT，FP，RP1，RP2，(其中除DL为10OD外，其余皆为2OD)；
[0040]DL(SEQ ID NO：2)为DNA文库；FS(SEQ ID NO：3)为荧光底物，序列为5
’‑
ACTCTTCCTAGCTATGGTTCGATCAAGA
‑3’
，第13位T碱基标记了FAM荧光基团、第15位T碱基标记了淬灭基团DABCYL；LT(SEQ ID NO：4)为连接模板，序列为5
’‑
CTAGGAAGAGTCGGACGGAGCTG
‑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种与心脏表面特异性结合的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列为SEQ ID NO：1。2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、氧甲基化、甲基化、氨基化、巯基化、氟化或同位素化。3.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列上偶联有荧光基团、淬灭基团、生物素、纳米材料、巯基、氨基或酶。4.一种与心脏表面特异性结合的核酸适配体，其特征在于，由权利要求1～3任意一项所述核酸适配体进行核苷酸删减、增加或置换后获得的具有相同特异性识别功能的单链DNA分子。5.权利要求1所述核酸适配体的筛选方法，其特征在于，以单链寡核苷酸片段为筛选材料，以H9C2细胞为正...

【专利技术属性】
技术研发人员：李磊，谢作益，吴连拼，吴树杰，杨守醒，吴信雷，张晶晶，
申请(专利权)人：温州医科大学附属第二医院温州医科大学附属育英儿童医院，
类型：发明
国别省市：