与胃癌化疗5-FU敏感性相关的多基因联合突变检测的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及与胃癌化疗5

【技术实现步骤摘要】
与胃癌化疗5
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FU敏感性相关的多基因联合突变检测的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体地，涉及与胃癌化疗5
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FU敏感性相关的多基因联合突变检测的试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]胃癌是全球发病率排名第三的常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率与病死率均保持逐年上升的趋势。而对于晚期胃癌患者多数已错过最佳治疗时期，尽管目前已有手术、放化疗、生物靶向治疗等多种治疗方法，但其5年生存率仍不到30％。化疗是当前胃癌治疗过程中重要的辅助治疗措施。其中5
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FU是胃癌化疗的基本用药，但患者因个体遗传学或表观遗传学差异导致对5
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FU个体敏感性迥异从而影响5
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FU总体疗效。因此，了解胃癌患者对5
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FU化疗药物敏感性的相关因素，对于胃癌患者进行精准治疗尤为重要。
[0003]叶酸代谢基因是调控肿瘤对氟尿嘧啶反应的重要因素，所以对于这些基因多态性的分析，有助于预测患者对于五氟尿嘧啶的反应。二氢叶酸还原酶(DHFR)在叶酸代谢途径中也起着重要作用。它催化氧化叶酸(如叶酸和二氢叶酸)还原为四氢叶酸。因此，补充叶酸的益处取决于DHFR活性。蛋氨酸合酶(MTR)是负责5
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甲基四氢叶酸甲基不可逆转移的酶，从而产生蛋氨酸，s
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腺苷甲硫氨酸(SAM)的前体，通用甲基供体。MTHFR是参与叶酸代谢途径的一种必需酶。它将5,10
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亚甲基四氢叶酸还原为5
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甲基四氢叶酸，这是同型半胱氨酸/蛋氨酸转化的甲基供体。5,10
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亚甲基四氢叶酸是氟尿嘧啶抑制胸苷酸合成酶(TS)的必要辅助因子，其可用性的增加可能导致体内氟尿嘧啶活性的变化.γ
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谷氨酰水解酶(GGH)是一种溶酶体酶，参与叶酸和抗叶酸的代谢。它作为一种内切和/或外切肽酶，在进入哺乳动物细胞后切割附着在叶酸和抗叶酸上的γ
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聚谷氨酸链。SLC19A1是叶酸营养素和抗叶酸疗法的主要转运蛋白，故而可以将SLC19A1作为多种生理和病理过程中的关键因子，也认可用来判断肿瘤对于氟尿嘧啶的反应。
[0004]氟尿嘧啶很大一部分作用来自其对DNA的损伤，而一些DNA损伤修复基因对于氟尿嘧啶的作用影响必定起着举足轻重的作用。X射线修复交叉互补蛋白1(XRCC1)在细胞中发挥着修复单链断裂和碱基切除的作用，DNA损伤识别与修复因子(XPC)编码的蛋白质对损伤感知和DNA结合很重要，并表现出对单链DNA的偏好，在全球基因组核苷酸切除修复(NER)的早期步骤中起着重要作用，ERCC1是核苷酸切除修复(NER)途径的关键调节因子,在核苷酸切除修复途径中起作用，并用于修复DNA损伤。
[0005]ABCC2、ABCC4同属于ATP结合盒(ABC)亚家族，ABC蛋白通过细胞膜外和细胞膜内运输各种分子,包括各类抗癌药物；CYP2B6编码细胞色素P450超酶家族的一员,它催化许多涉及药物代谢和胆固醇、类固醇和其他脂类合成的反应，这类药物运输、代谢调控因子在必然也是氟尿嘧啶发挥作用的重要一环。
[0006]众所周知，氟尿嘧啶最为重要的作用在于其对于细胞嘧啶合成的干扰，对于细胞嘧啶池调控的基因一定对氟尿嘧啶的作用敏感性有着重要的调控作用，CDA编码了一种参
与打捞嘧啶的酶,它是负责维持细胞嘧啶池的几种脱氨酶之一；UMPS编码一种双功能酶，催化从头嘧啶生物合成途径的最后两个步骤。
[0007]有研究表明许多化疗药物通过产生反应性物质而具有细胞毒性，与氧化应激相关的基因变异可能会影响肿瘤患者化疗效果和预后，CBR3作为氧化还原应激相关的基因，其对氟尿嘧啶的作用效果影响也是值得探究的一环。
[0008]FCGR3A编码免疫球蛋白G Fc部分的受体，并参与从循环中去除抗原抗体复合物,能够增强抗体依赖的细胞毒作用来杀伤肿瘤细胞,DYNC2H1的长链非编码RNA(lncRNA)在调节肿瘤的化学敏感性方面起着至关重要的作用，这二者也常作为化疗药物疗效的调控因子被提及。
[0009]目前检测基因突变的方法主要有2种：荧光定量PCR法、一代测序法。PCR法检测突变点，通常一个体系只能检出一个突变位点，容易出现假阳性；检测多突变位点操作繁琐，需要样本量较大。一代测序法每次只能对一个样品的某一段区域进行测序，因此检测效率低，检测成本高；而且由于一代测序法测序原理的限制，在检测带有杂合子的样品信号时会出现双峰乃至多峰，使得该样品无法被准确识别出来，导致检测灵敏度低(20％)，假阴性率较高。
[0010]因此，市场上急需一种新的方法和新的试剂盒同时检查胃癌化疗敏感性相关基因，能同时检测多个基因、降低样本的需求量和降低检测成本；同时还能提高检测的灵敏度和准确性。

技术实现思路

[0011]针对上述问题，本专利技术的目的一在于提供与胃癌化疗5
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FU敏感性相关的多基因联合突变检测的试剂盒，目的二在于提供利用所述试剂盒检测与胃癌化疗5
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FU敏感性相关的多基因联合突变的方法，目的三在于提供上述试剂盒或方法在与胃癌化疗5
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FU敏感性相关的多基因联合突变检测方面的应用。本专利技术所提供的检测方法、引物及试剂盒是基于半导体测序平台对胃癌DFHR、MTR、MTHFR、GGH、SLC19A1、CDA、XPC、UMPS、FCGR3A、CYP2B6
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1、ABCC2、DYNC2H1、CBR3、ABCC4基因多个区域同时进行测序，不仅大大提高了检测的效率、准确性和灵敏度同时降低了检测成本；还为胃癌的个体化化疗敏感用药提供强有力的依据。
[0012]本专利技术采用的具体方案为：第一方面，与胃癌化疗5
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FU敏感性相关的多基因联合突变检测的试剂盒，所述试剂盒检测与胃癌化疗5
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FU敏感性密切相关的代谢通路基因DFHR、MTR、MTHFR、GGH、SLC19A1、CDA、XPC、UMPS、FCGR3A、CYP2B6
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1、ABCC2、DYNC2H1、CBR3和ABCC4的突变情况；所述试剂盒包括文库构建试剂盒、接头试剂盒和磁珠试剂盒；所述的文库构建试剂盒包括：片段捕获反应液、扩增引物、引物消化酶、连接缓冲液、DNA连接酶、文库扩增反应液、文库引物混合液和洗脱液；其中，所述扩增引物信息如下：所述DFHR的SNP位点为rs1650697和rs442767，扩增rs1650697的引物如SEQ ID NO：35～36所示，扩增rs442767的引物如SEQ ID NO：37～38所示；所述MTR的SNP位点为rs1805087，扩增rs1805087的引物如SEQ ID NO：39～40所示；所述MTHFR的SNP位点为rs1801131和rs1801133，扩增1801131的引物如SEQ ID NO：41～
42所示；扩增rs18011本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.与胃癌化疗5
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FU敏感性相关的多基因联合突变检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒检测与胃癌化疗5
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FU敏感性密切相关的代谢通路基因DFHR、MTR、MTHFR、GGH、SLC19A1、CDA、XPC、UMPS、FCGR3A、CYP2B6
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1、ABCC2、DYNC2H1、CBR3和ABCC4的突变情况；所述试剂盒包括文库构建试剂盒、接头试剂盒和磁珠试剂盒；所述的文库构建试剂盒包括：片段捕获反应液、扩增引物、引物消化酶、连接缓冲液、DNA连接酶、文库扩增反应液、文库引物混合液和洗脱液；其中，所述扩增引物信息如下：所述DFHR的SNP位点为rs1650697和rs442767，扩增rs1650697的引物如SEQ ID NO：35~36所示，扩增rs442767的引物如SEQ ID NO：37~38所示；所述MTR的SNP位点为rs1805087，扩增rs1805087的引物如SEQ ID NO：39~40所示；所述MTHFR的SNP位点为rs1801131和rs1801133，扩增1801131的引物如SEQ ID NO：41~42所示；扩增rs1801133的引物如SEQ ID NO：43~44所示；所述GGH的SNP位点为rs11545078，扩增rs11545078的引物如SEQ ID NO：45~46所示；所述SLC19A1的SNP位点为rs1051298，扩增rs1051298的引物如SEQ ID NO：47~48所示；所述CDA的SNP位点为rs60369023，扩增rs60369023的引物如SEQ ID NO：49~50所示；所述XPC的SNP位点为rs2228001，扩增rs2228001的引物如SEQ ID NO：51~52所示；所述UMPS的SNP位点为rs1801019，扩增rs1801019的引物如SEQ ID NO：53~54所示；所述FCGR3A的SNP位点为rs396991，扩增rs396991的引物如SEQ ID NO：55~56所示；所述CYP2B6
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1的SNP位点为rs3211371，扩增rs3211371的引物如SEQ ID NO：57~58所示；所述ABCC2的SNP位点为rs12762549，扩增rs12762549的引物如SEQ ID NO：59~60所示；所述DYNC2H1的SNP位点为rs716274，扩增rs716274的引物如SEQ ID NO：61~62所示；所述CBR3的SNP位点为rs1056892，扩增rs105689...

【专利技术属性】
技术研发人员：马强，赵丽瑛，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：