一种节杆菌C2及其重组节杆菌在降解木质素中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种节杆菌C2及其重组节杆菌在降解木质素中的应用，属于木质素降解技术领域。本发明专利技术提供的耐冷木质素降解节杆菌（Arthrobactersp.）C2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年9月7日，保藏编号为CGMCC No.20606。本发明专利技术的节杆菌C2及其重组节杆菌能够在25℃以下的环境中有效降解木质素，提高了菌株的低温适应能力和木质素的降解率，提高了严寒地区秸秆还田的效率，降低了成本，提高了经济效益。提高了经济效益。提高了经济效益。

【技术实现步骤摘要】
一种节杆菌C2及其重组节杆菌在降解木质素中的应用


[0001]本专利技术涉及木质素降解
，尤其涉及一种节杆菌C2及其重组节杆菌在降解木质素中的应用。

技术介绍

[0002]木质素是由各种芳香族单体结构组成的复杂大分子化合物，各种单体之间通过醚键与碳碳键相连接。作为秸秆的重要组成成分之一，木质素的结构组成十分稳定，难以被微生物水解酶降解。同时，由于我国北方地区冬季时间长，平均气温低，严重影响了微生物降解秸秆的效率，阻碍秸秆还田工作的推进。因此，提高耐冷木质素降解菌的低温耐受能力及低温木质素降解能力对于提高秸秆降解效率，同时推进北方秸秆还田工作进程有非常重要的意义。
[0003]生物处理法是微生物通过生理代谢产生各种水解酶降解木质素，其降解酶包括：染料脱色过氧化物酶（Dye
‑
decolorizing peroxidase, DyP）、锰过氧化物酶（manganese peroxidase, MnP）、漆酶（laccase, Lac）、木质素过氧化物酶（lignin peroxidase, LiP）。其中，染料脱色过氧化物酶是一类含血红素的微生物过氧化物酶，它可以参与菌体氧化应激调节，提高菌体对氧化能力抗性，并且对木质素的降解发挥重要的作用，是处理农业废料等生物生产工艺过程中的理想酶。
[0004]研究表明，当环境温度降低时，生物体内一种蛋白的表达水平会显著提高，被称为“冷休克蛋白(coldshockprotein, Csp)”。Csp是一类结构高度保守，分子量约7.4 KDa的核酸结合蛋白，被发现广泛存在于各种微生物体内，并对微生物的耐冷适应机制发挥着重要的作用。Csp作为分子伴侣能够在冷应激时上调表达，增加翻译效率，以这种方式改善微生物在低温下受到抑制的生理代谢，增强菌体的低温适应能力。
[0005]存在于低温环境中的微生物，在长期的进化中获得了能够在寒冷环境中生存的能力。它们具有独特的低温启动子，使RNA聚合酶即使在0℃也能进行基因的高效转录。目前，国际上有关低温启动子的研究主要以大肠杆菌冷休克蛋白启动子为主，但研究表明，冷休克蛋白启动子并非完全温度敏感型启动子，其能够在常温下微弱转录，并且在低温下增强转录，而不需要其他调控因子的参与。因此，将低温启动子用于构建温度敏感型表达载体，可以使载体通过温度变化控制目的基因的表达，不需要外源诱导剂的添加，避免了过度的经济支出以及化学药剂对细胞造成毒性。这使得低温表达系统具有着广阔的应用前景。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种节杆菌C2及其重组节杆菌在降解木质素中的应用。本专利技术的节杆菌C2和重组节杆菌能够在25℃以下的环境中有效降解木质素，提高了菌株的低温适应能力和木质素的降解率，提高了严寒地区秸秆还田的效率，降低了成本，提高了经济效益。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一株耐冷木质素降解节杆菌（Arthrobactersp.）C2，所述节杆菌C2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号
院3号，保藏日期为：2020年9月7日，保藏编号为CGMCC No.20606。
[0008]本专利技术还提供了一种上述节杆菌C2在降解木质素中的应用，所述节杆菌C2降解木质素时的温度为15~25℃。
[0009]本专利技术还提供了一种来自上述节杆菌C2基因组的低温诱导型强启动子P
2789
，所述强启动子P
2789
的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
[0010]本专利技术还提供了一种重组节杆菌，以上述节杆菌C2为底盘微生物，包含目的基因和上述强启动子P
2789
。
[0011]优选的，所述目的基因为冷休克蛋白基因和/或染料脱色过氧化物酶基因。
[0012]优选的，所述目的基因位于所述强启动子P
2789
的下游。
[0013]本专利技术还提供了一种上述重组节杆菌的构建方法，将冷休克蛋白基因串联至启动子P
2789
下游并在所述节杆菌C2中过表达得到重组节杆菌C2 pA
‑
Csp；将染料脱色过氧化物酶基因串联至启动子P
2789
下游并在所述节杆菌C2中过表达得到重组节杆菌C2 pA
‑
DyP；将冷休克蛋白基因和染料脱色过氧化物酶基因串联至启动子P
2789
下游并在所述节杆菌C2中过表达得到重组节杆菌C2 pA
‑
PCD。
[0014]本专利技术还提供了一种上述重组节杆菌在降解木质素中的应用，所述重组节杆菌降解木质素时的温度为15~25℃。
[0015]本专利技术提供了一种节杆菌C2及其重组节杆菌在降解木质素中的应用。本专利技术以节杆菌C2为底盘微生物，筛选出了能够在低温条件下诱导基因高效表达的低温诱导型强启动子P
2789
，通过将该启动子与冷休克蛋白基因和/或染料脱色过氧化物酶基因串联，并在节杆菌C2过表达，制备得到了单基因过表达重组节杆菌C2 pA
‑
Csp和C2 pA
‑
DyP，双基因共表达重组菌C2 pA
‑
PCD。
[0016]本专利技术的节杆菌C2和重组节杆菌C2 pA
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Csp、C2 pA
‑
DyP、C2 pA
‑
PCD能够在25℃以下的环境中有效降解木质素，当培养温度是15℃，培养时间7 d的时候，检测出木质素降解率可达44.14%。本专利技术提供的节杆菌C2及其重组节杆菌显著提高了菌株的低温适应能力和木质素的降解率，为提高严寒地区秸秆还田效率提供了优质的菌种资源和菌种改造技术方法。
附图说明
[0017]图1为筛选出来的菌株C2在苯胺蓝固体培养基中产生的脱色圈。
[0018]图2为菌株C2的菌落形态分布图。
[0019]图3为菌株C2经革兰氏染色后在光学显微镜下的菌体形态图。
[0020]图4为菌株C2在透射电镜下的菌体形态图。
[0021]图5为菌株C2的16S rDNA序列扩增产物电泳检验图。
[0022]图6为基于16S rDNA序列的菌株C2相似菌株的系统发育树。
[0023]图7为提取的节杆菌C2基因组DNA的电泳检测结果图。
[0024]图8为启动子PCR扩增产物电泳检测结果图，条带1为P
0229
，条带2为P
1273
，条带3为P
1513
，条带4为P
2014
，条带5为P
2789
，条带6为P
3150
，条带7为P
3160
。
[0025]图9为启动子片段与pUCm
‑
T克隆载体的连接过程示意图。
[0026]图10为pET
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株耐冷木质素降解节杆菌（Arthrobactersp.）C2，其特征在于，所述节杆菌C2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年9月7日，保藏编号为CGMCC No.20606。2.一种权利要求1所述的节杆菌C2在降解木质素中的应用，其特征在于，所述节杆菌C2降解木质素时的温度为15~25℃。3.一种来自权利要求1所述节杆菌C2基因组的低温诱导型强启动子P
2789
，其特征在于，所述强启动子P
2789
的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。4.一种重组节杆菌，其特征在于，以权利要求1所述的节杆菌C2为底盘微生物，包含目的基因和权利要求3所述强启动子P
2789
。5.如权利要求4所述的重组节杆菌，其特征在于，所述目的基因为冷休克蛋白基因和/或染料脱色过氧化物酶基因。6.如权利要求5所...

【专利技术属性】
技术研发人员：成毅，吴林轩，姜涵奕，李春艳，臧海莲，赵昕悦，黄馨凝，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：