TBO作为封闭剂提高DAPI对植物细胞染色特异性的方法技术

本发明专利技术公开了一种TBO作为封闭剂提高DAPI对植物细胞染色特异性的方法，该方法适用于植物细胞，要求在常规的DAPI染色前，使用TBO作为封闭剂来处理样品，以减少DAPI染料的非特异性结合，显著提高DAPI染色的信号。本发明专利技术操作简单、可重复性强，可显著提高DAPI染色的特异性，降低样品非特异吸附DAPI染料而带来的背景荧光。光。光。

【技术实现步骤摘要】
TBO作为封闭剂提高DAPI对植物细胞染色特异性的方法


[0001]本专利技术属于细胞生物学生物样品染色领域，尤其涉及TBO作为封闭剂在植物细胞DAPI染色中的应用。

技术介绍

[0002]DAPI(4',6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚)是一种DNA染色试剂，它能特异地与双链DNA分子结合，其激发波长为358纳米，发射波长为461纳米。不像动物细胞，植物细胞除原生质体外，还包含细胞壁。细胞壁的存在经常导致一部分DAPI染料非特异地被吸附在其上而带来很强的背景荧光信号，从而干扰了DAPI对植物细胞DNA的特异性染色。更有甚者，在一些物种花粉细胞的壁及细胞质上，会出现非常强的非特异性吸附，致使DAPI染色无法清晰地观察到细胞器DNA(线粒体或者质体DNA)(图1A，箭头)。这种现象产生的原因在于非特异性信号太强，致使DNA特异性染色信号相对变弱，是无法通过增加荧光信号的曝光时间来改善的。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种TBO作为封闭剂提高DAPI对植物细胞染色特异性的方法。
[0004]本专利技术采用的技术方案具体如下：
[0005]一种TBO作为封闭剂提高DAPI对植物细胞染色特异性的方法，具体为：先将TBO作为封闭剂对植物细胞样品进行处理，使TBO先占据样品中的非特异吸附位点，再使用DAPI染料对TBO处理后的样品进行染色，从而提高DAPI对染料对样品中DNA染色的特异性。
[0006]本专利技术借鉴了Western blot或者Southern blot中的“封闭”原理，尝试用不同的试剂对植物细胞进行封闭处理，以降低其对DAPI试剂的非特异性吸附。具体地，通过将植物细胞先与某种封闭试剂温育，使细胞能够先非特异地吸附这些封闭试剂而封闭住那些非特异性吸附位点，就能减少随后DAPI染色过程中这些位点对DAPI试剂的非特异性吸附，从而达到降低背景荧光的目的。这种封闭试剂的基本特征是：(1)能高效地与植物细胞吸附；(2)在DAPI激发光波长下，并不产生荧光或者仅产生弱荧光，因而并不影响DAPI的使用。为此，本专利技术大规模筛选了常用的染色试剂，其中甲苯胺蓝
‑
O(Toluidine Blue O，简称TBO，分子结构见图2)是一种有效地植物细胞DAPI染色封闭剂。
[0007]TBO在生物学研究中常用作染色剂(Martin and Burch,1988；Flint,1990)，其上的阳离子能与组织中的酸性物质相结合，而其颜色来自TBO上的两个发色团：胺基和醌型苯环。在可见光下，TBO便能使染色组织呈色，其颜色的色彩与溶液pH值有关。尽管TBO作为生物组织的染色剂也被广泛使用，但其作为封闭剂用于生物组织染色从未被报道过。与TBO作为染色剂的原理不同，本方法主要将TBO用作封闭剂。将它先与植物细胞温育，使其先占据细胞壁壁及细胞质中的那些非特异吸附位点，从而减少这些位点对DAPI染料的非特异吸附，达到提高DAPI对细胞染色的特异性。如图1B所示，以花粉细胞为例，花粉细胞经过TBO封闭处理后，花粉壁上的荧光几乎不存在(箭标)，细胞质中的非特异染色明显减弱，核DNA和
细胞器DNA染色信号相较于背景信号明显增强(图1B，箭头)。
[0008]进一步地，所述将TBO作为封闭剂对样品进行处理具体为：用0.5wt％TBO染色液处理样品10分钟，处理完成的样品用蒸馏水清洗干净。
[0009]进一步地，所述提高DAPI对植物细胞染色特异性包括提高DAPI染料对细胞核DNA、线粒体DNA、质体DNA染色的特异性。
[0010]本专利技术的有益效果是：能显著降低DAPI染色的非特异背景，从而提高DAPI染色的特异性。
附图说明
[0011]图1花粉细胞的DAPI染色；A，未经TBO封闭的花粉细胞DAPI染色；B，经TBO封闭的花粉细胞DAPI染色。GCN，生殖细胞细胞核；VCN，营养细胞细胞核。箭头，细胞器DNA信号；箭标，花粉壁信号。标尺，10微米。
[0012]图2TBO的分子结构式；
具体实施方式
[0013]本专利技术提供了一种基于TBO作为封闭剂提高DAPI对植物细胞染色特异性的方法，可以显著提高DAPI对样品染色的特异性。这种方法基于TBO先封闭实验样品，从而降低样品非特异吸附DAPI染料，从而提高DAPI对DNA染色的特异性。本方法针对的是含细胞壁的植物细胞，尤其是花粉细胞，因此，本专利技术仅适用于植物细胞。
[0014]本专利技术需要在DAPI染料染色实验样品前，先用TBO预处理实验样品，让样品中的非特异吸附位点先吸附TBO染料，从而降低样品对DAPI染料的非特异吸附，从而提高DAPI染料对DNA染色的特异性。
[0015]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明：
[0016]实施例1：TBO作为封闭剂在DAPI染色中的应用。
[0017]从开放的花朵中，收集成熟的花粉细胞，经过多聚甲醛室温固定4小时，并利用PBS清洗样品。清洗完成的花粉细胞，用低熔点琼脂糖收集。待低熔点琼脂糖固化后，将样品用刀片切成小块，每一小块中便包含了多个花粉细胞。利用无水乙醇对样品脱水后，加入Technovit树脂对样品进行包埋、固化。对Technovit包埋的样品用半薄切片机切片获得500纳米厚度的花粉切片，分为对照组和实验组，其中对照组直接进行DAPI染色，DAPI染色步骤：将获得的花粉切片用蒸馏水铺展于载玻片上，待蒸馏水被烘干后，切片将粘附于载玻片上；然后滴加1μg/ml的DAPI染液对切片染色10分钟，染色完成后，用PBS溶液清洗3遍(每遍5分钟)后用于荧光观察。对于实验组，将获得的花粉切片先用TBO处理：先用0.5wt％TBO染色液处理切片10分钟，处理完成的样品用蒸馏水清洗5分钟后再进行如前步骤的DAPI染色。
[0018]图1A显示了未改进的DAPI染色方法对花粉细胞的染色效果，可见非特异背景高，尤其是花粉细胞处的DAPI吸附异常高，DAPI对DNA染色的效果差；图1B显示了花粉细胞切片经过TBO处理后，再经DAPI染色，其染色的特异性显著提高。表现在花粉细胞壁及细胞质对DAPI的非特异性吸附明显降低，从而提高了DAPI染色对细胞核DNA(VCN及GCN所示)及细胞器DNA(箭头所示)的特异性。
[0019]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对
于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法把所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本专利技术的保护范围。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种TBO作为封闭剂提高DAPI对植物细胞染色特异性的方法，其特征在于，具体为：先将TBO作为封闭剂对植物细胞样品进行处理，使TBO先占据样品中的非特异吸附位点，再使用DAPI染料对TBO处理后的样品进行染色，从而提高DAPI染料对样品DNA染色的特异性。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丹阳，石娇娇，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：