一种气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种气道上皮细胞SHP

【技术实现步骤摘要】
一种气道上皮细胞SHP
‑
1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种气道上皮细胞SHP
‑
1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]目前，进行基因功能研究最直接有效的方法是构建转基因和/或基因敲除动物模型。CRISPR/Cas9技术通过导向RNA(sgRNA)介导核酸内切酶Cas9蛋白进行靶向DNA序列识别并造成DNA双链断裂，以同源重组或非同源末端连接方式修复受损DNA，从而实现对目标位点实现基因的定点敲除和/或敲入等多种修饰。
[0003]条件性基因敲除动物模型主要是通过特异性重组酶系统Cre
‑
LoxP来实现，将带有特定flox位点的转基因小鼠与细胞特异性表达Cre酶的转基因小鼠杂交可以获得特定组织细胞中基因敲除的小鼠。这种条件基因敲除的方法需要同时构建两种转基因小鼠(Flox小鼠和Cre小鼠)，且更换Cre酶的基因启动子可以实现多种条件(如药物诱导、特定时间、特定组织等)下基因敲除。
[0004]Src同源区2蛋白酪氨酸磷酸酶
‑
1(Src Homology 2domain
‑
containing protein tyrosine Phosphatase
‑
1，SHP
‑
1)，由PTPN6(SHP
‑
1、PTP1C、HCP)基因编码。SHP
‑
1高表达于造血细胞，而低表达于上皮细胞，对于多种细胞因子、生长因子受体和免疫受体具有负调节作用。有文献报道，全身性SHP
‑
1功能缺陷小鼠肺组织中可出现自发性Th2型炎症反应，包括嗜酸性粒细胞增多症、粘液化生、气道上皮细胞肥大、气道高反应性、上皮细胞和肺纤维化等。
[0005]目前，气道上皮细胞SHP
‑
1在哮喘、慢阻肺或肺纤维化等呼吸系统重大慢性疾病中的功能尚不清楚。因此，提供一种构建气道上皮细胞SHP
‑
1基因特异性敲除小鼠的模型，对于研究哮喘、慢阻肺和肺纤维化等具有重要意义。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种气道上皮细胞SHP
‑
1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法及其应用。本专利技术基于CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的原理，对SHP
‑
1靶基因进行定点修饰，构建Flox小鼠，再与CC10
‑
CreER工具鼠杂交，筛选基因型为CC10
‑
CreER
+/
‑
×
SHP
‑1fl/fl
的SHP
‑1Δ/Δ
小鼠，再利用气道上皮细胞Clara蛋白(CC10)启动Cre系统诱导SHP
‑
1特异性敲除，构建了一种气道上皮细胞SHP
‑
1基因特异性敲除的小鼠模型。本专利技术中所述SHP
‑1Δ/Δ
小鼠的构建方法基于CRISPR/Cas9技术，解决了传统基因敲除技术中基因脱靶率高、动物成活率低的问题，筛选出气道上皮细胞SHP
‑
1基因特异性敲除的纯合后代，在哮喘、慢阻肺、肺纤维化等呼吸系统重大慢性疾病机制研究及药物制备方面具有重要应用价值。
[0007]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种靶向小鼠SHP
‑
1基因的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
[0009]在本专利技术中，所述靶向小鼠SHP
‑
1基因的sgRNA的作用位点为SHP
‑
1基因Exon2
‑
Exon9的侧翼区域，所述sgRNA的编辑效率高，脱靶率低，1loxp同源重组效率为18.18％，而对应编号的2loxp全部实现同源重组(效率为100％)。
[0010]第二方面，本专利技术提供一种靶向小鼠SHP
‑
1基因的基因编辑系统，所述基因编辑系统包括第一方面所述的靶向小鼠SHP
‑
1基因的sgRNA。
[0011]优选地，所述sgRNA分别靶向SHP
‑
1基因Exon9的下游和SHP
‑
1基因Exon2的上游。
[0012]优选地，所述基因编辑系统还包括Cas9 mRNA和同源重组Donor。
[0013]优选地，所述同源重组Donor中含有loxP元件，所述同源重组Donor中含有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。
[0014]优选地，所述同源重组Donor的构建引物包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
[0015]本专利技术中，所述同源重组Donor的结构为具有100bp的双翼同源臂，并且靶点处插入loxP元件序列及外侧20
‑
24bp保护碱基的单链DNA。所述同源重组Donor的构建引物包括：1loxp
‑
sg1
‑
F(SEQ ID NO:3)、1loxp
‑
sg1
‑
R(SEQ ID NO:4)、2loxp
‑
sg2
‑
F(SEQ ID NO:5)和2loxp
‑
sg2
‑
R(SEQ ID NO:6)。
[0016]第三方面，本专利技术提供一种气道上皮细胞SHP
‑
1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
[0017](1)构建第二方面所述的靶向小鼠SHP
‑
1基因的基因编辑系统；
[0018](2)利用步骤(1)所述基因编辑系统对小鼠受精卵进行基因编辑，再进行杂交，构建Flox小鼠；
[0019](3)将Flox小鼠与CC10
‑
CreER工具鼠杂交，筛选基因型为CC10
‑
CreER
+/
‑
×
SHP
‑1fl/fl
的小鼠，利用气道上皮细胞Clara蛋白启动Cre系统诱导，构建气道上皮细胞SHP
‑
1基因特异性敲除的小鼠模型。
[0020]优选地，所述构建方法包括如下具体步骤：
[0021](a)分别制备靶向小鼠SHP
‑
1基因的sgRNA、Cas9 mRNA和同源重组Donor；
[0022](b)将sgRNA、Cas9 mRNA和Donor同时注射到小鼠受精卵中，经基因整合，得到SHP
‑
1基因Exon9的下游和Exon2的上游分别插入含有loxP元件的片段的基因重本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向小鼠SHP
‑
1基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。2.一种靶向小鼠SHP
‑
1基因的基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包括权利要求1所述的靶向小鼠SHP
‑
1基因的sgRNA；优选地，所述sgRNA分别靶向SHP
‑
1基因Exon9的下游和SHP
‑
1基因Exon2的上游；优选地，所述基因编辑系统还包括Cas9 mRNA和同源重组Donor；优选地，所述同源重组Donor中含有loxP元件，所述同源重组Donor中含有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；优选地，所述同源重组Donor的构建引物包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。3.一种气道上皮细胞SHP
‑
1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：(1)构建权利要求2所述的靶向小鼠SHP
‑
1基因的基因编辑系统；(2)利用步骤(1)所述基因编辑系统对小鼠受精卵进行基因编辑，再进行杂交，构建Flox小鼠；(3)将Flox小鼠与CC10
‑
CreER工具鼠杂交，筛选基因型为CC10
‑
CreER
+/
‑
×
SHP
‑1fl/fl
的小鼠(SHP
‑1Δ/Δ
)，利用气道上皮细胞Clara蛋白启动Cre系统诱导，构建气道上皮细胞SHP
‑
1基因特异性敲除的小鼠模型。4.根据权利要求3所述的气道上皮细胞SHP
‑
1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下具体步骤：(a)分别制备靶向小鼠SHP
‑
1基因的sgRNA、Cas9 mRNA和同源重组Donor；(b)将sgRNA、Cas9 mRNA和Donor同时注射到小鼠受精卵中，经基因整合，得到SHP
‑
1基因Exon9的下游和Exon2的上游分别插入含有loxP元件片段的基因重组受精卵，将注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠子宫中，得到F0代小鼠；(c)将F0代中的阳性小鼠与野生型小鼠WT进行交配，获得F1代小鼠，在F1代杂合子小鼠SHP
‑1fl/WT
之间进行杂交，得到可稳定传代的F2代小鼠，对获得的F2代小鼠进行PCR鉴定和测序，筛选F2代纯合子Flox小鼠(SHP
‑1fl/fl
)和杂合子Flox小鼠(SHP
‑1fl/WT
)；(d)将F2代纯合子SHP
‑1fl/fl
小鼠或杂合子SHP
‑1fl/WT
小鼠与CC10
‑
CreER工具鼠杂交，筛选出基因型为CC10
‑
CreER
+/
‑
×
SHP
‑1fl/WT
的F3代小鼠；(e)将筛选出的F3代小鼠与F2代纯合子SHP
‑1fl/fl
小鼠回交，筛选出基因型为CC10
‑
CreER
+/
‑
×
SHP
‑1fl/fl
的F4代SHP
‑1Δ/Δ
小鼠；(f)F4代SHP
‑1Δ/Δ
小鼠通过腹腔注射他莫昔芬，构建气道上皮细胞SHP
‑
1基因特异性敲除的小鼠模型。5.根据权利要求4所述的气道上皮细胞SHP
‑
1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述SHP
‑
1基因Exon9的下游插入含有loxP元件的片段，包括如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；优选地，所述SHP
‑
1基因Exon2的上游插入含有loxP元件的片段，包括如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。6.根据权利要求4或5所述的气道上皮细胞SHP
‑
1基因特异性敲除小鼠模型的构建方
法，其特征在于，步骤(c)中，所述对获得的F2代小鼠进行PCR鉴定的特异性引物对包括：短链筛选鉴定引物对：鉴定SHP
‑
1基因Exon2的上游是...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈子，周林福，殷稚飞，徐双兰，葛林阳，吴迪，张流超，马陈慧，刘伟华，蒋静娴，
申请(专利权)人：南京市高淳人民医院无锡市第二人民医院南京宽诚科技有限公司，
类型：发明
国别省市：