METTL5基因对肺腺癌细胞迁移与侵袭影响的实验方法技术

本发明专利技术公开METTL5基因对肺腺癌细胞迁移与侵袭影响的实验方法。采用公共基因表达数据集数据库，分析肺腺癌及癌旁组织METTL5的表达，Westernblot检测正常肺上皮BEAS

【技术实现步骤摘要】
METTL5基因对肺腺癌细胞迁移与侵袭影响的实验方法


[0001]本专利技术涉及METTL5
，尤其涉及METTL5基因对肺腺癌细胞迁移与侵袭影响的实验方法。

技术介绍

[0002]2021年统计数据显示，肺癌位居全球癌症相关死亡之首，每年因肺癌死亡人数达180万。我国每年肺癌新发及死亡患者分别占全球37％及39.8％。肺癌主要分非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌两种类型，其中非小细胞肺癌占总数的85％左右，肺腺癌又是其中最常见类型。除常规的放疗、化疗以及手术治疗等手段外，近年来随着靶向及免疫治疗的长足发展，使肺腺癌患者生存有了明显改善，但患者五年总生存仍不足20％。因此探究肺癌发病机制，寻找新的治疗靶点，是目前研究的临床科学问题之一。据报道，近来作为研究热点的m6A转录后修饰在肿瘤发生发展中发挥重要作用。本研究探讨了m6A相关修饰酶METTL5在肺腺癌中的可能作用，揭示了METTL5可能通过调控上皮间质转化(EMT)相关分子促进肺腺癌细胞系A549、H1975细胞迁移、侵袭。
[0003]m6A RNA甲基化修饰属于表观转录组学范畴，指通过RNA修饰与编辑介导基因转录后水平调控，近年来受到广泛关注。研究发现，m6A修饰在各种RNA中均丰富而保守，表明其广泛调控基因表达。m6A修饰通过对癌基因表达的调节，调控肿瘤的发生与进展。Li等分析TCGA数据库及临床肿瘤组织，研究发现METTL3的高水平与结直肠癌患者较短的总生存期及无进展生存期显著相关。Liu等研究表明以m6A依赖的方式增强EIF3C的翻译，并同时促进整体翻译输出，从而促进卵巢癌的发生和转移。随着研究的深入，m6A修饰在肺腺癌进展中的机制也逐渐被揭示。Yin等发现RMRP(RNA component of mitochondrial RNA
‑
processing endoribonuclease)在NSCLC中高表达，METTL3通过提高RMRP RNA的m6A水平增强其稳定性，通过调节TGFBR1/SMAD2/SMAD3途径使NSCLC进展。目前METTL5在NSCLC中的作用机制尚未见报道。因此，本研究拟通过体外细胞学实验探究METTL5对NSCLC细胞增殖和迁移的影响及作用机制，为NSCLC的治疗提供潜在的有效分子靶点。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供METTL5基因对肺腺癌细胞迁移与侵袭影响的实验方法，以解决上述技术问题。
[0005]为实现上述目的本专利技术采用以下技术方案：
[0006]METTL5基因对肺腺癌细胞迁移与侵袭影响的实验方法，包括以下步骤：
[0007]步骤1、细胞培养、转染及稳转株筛选；
[0008]A549细胞及H1975细胞使用RPMI
‑
1640完全培养基培养，当细胞汇合度达到90％左右并处于对数生长期时，消化并重悬A549细胞及H1975细胞接种于6孔板中，分别使用NC及METTL5的干扰慢病毒按说明书进行转染，分为NC及shMETTL5组，72h后通过荧光显微镜观察荧光，重新铺板，加入5ug/ml嘌呤霉素，筛选METTL5敲低的稳转株；
[0009]步骤2、临床数据分析
[0010]首先在基因表达数据集(GEO)中搜索肺腺癌数据，下载数据集，分析METTL5表达情况，利用GEPIA根据METTL5的表达差异对肺腺癌患者进行生存分析，绘制Kaplan
‑
Meier生存曲线；
[0011]步骤3、Western blot法检测；
[0012]取经嘌呤霉素筛选后、镜下可见荧光的两组细胞，使用蛋白裂解液2
×
loading buffer裂解细胞提取蛋白，并在95℃条件下金属浴10min使蛋白边变性，吸取8μl样品加入上样孔中，使用140V电泳60min，200mA转膜90min，5％脱脂牛奶进行封闭，1h后TBST清洗PVDF膜3次，将PVDF膜与一抗室温孵育2h，TBST将PVDF膜清洗3次后放于HRP标记的Anti
‑
rabbit IgG二抗1:2000中孵育1h，TBST清洗后使用超敏发光液进行显影；
[0013]步骤4、Transwell
TM
实验检测；
[0014]检测迁移能力时，将处于对数生长期的NC组、shMETTL5组A549和H1975细胞消化并离心重悬，计数并将细胞浓度调节至1
×
105/ml，向上室中每孔加入200ul细胞悬液，并在下室中加入800ul的1640完全培养基，培养24h，弃上层液体，PBS清洗两次，用棉签拭去上室内的细胞，将小室置于固定液中固定20min，弃去固定液，清洗后将小室置于0.1％结晶紫染液中染色15min，再次清洗并晾干，放于显微镜下拍照计数，检测侵袭能力时，先将Matrigel基质胶与1640培养基1:20均匀混合后，向上室内每孔加入100ul混合液，置于培养箱中过夜，然后加入细胞悬液；
[0015]步骤5、统计分析；
[0016]采用Graph Pad Prism软件进行统计学分析，免疫印迹实验结果中的平均灰度值比值及Transwell
TM
实验细胞数都以均数
±
标准差表示，采用One Way ANOVA，即单因素方差分析用来总体分析后，一旦确定均值间存在差值，两两范围检验和成对多重比较确定哪些均值存在显著性差异，P<0.05作为差异有统计学意义。
[0017]作为本专利技术进一步的方案，步骤1中RPMI
‑
1640完全培养基培养，含10％FBS、1％青链霉素双抗，培养箱条件为37℃、5％CO2。
[0018]作为本专利技术进一步的方案，步骤3中一抗为Anti
‑
human METTL5多克隆抗体1:1000、Anti
‑
human GAPDH单克隆抗体1:2000。
[0019]作为本专利技术进一步的方案，步骤4中完全培养基为20％FBS。
[0020]作为本专利技术进一步的方案，步骤4中固定液为4％多聚甲醛溶液。
[0021]作为本专利技术进一步的方案，步骤4中并在下室中加入800ul的1640完全培养基，培养24h，培养条件为：37℃、5％浓度的CO2。
[0022]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：通过该实验方法发现敲低METTL5能够显著抑制肺腺癌细胞的EMT，从而抑制肺腺癌细胞的迁移、侵袭能力，表明METTL5通过促进肺腺癌细胞EMT进程进而促进肺腺癌进展。METTL5在肺腺癌中高表达，其表达水平与患者预后呈明显负相关，并且METTL5通过促进肺腺癌细胞EMT进程促进肺腺癌迁移、侵袭。METTL5可能在肺腺癌进展中发挥重要作用。因此，靶向METTL5有望成为治疗肺腺癌的潜在靶点。
附图说明
[0023]图1生物信息学分析METTL5在肺腺癌组织中的表达及其与患者预后的关系图；
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.METTL5基因对肺腺癌细胞迁移与侵袭影响的实验方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、细胞培养、转染及稳转株筛选；A549细胞及H1975细胞使用RPMI
‑
1640完全培养基培养，当细胞汇合度达到90％左右并处于对数生长期时，消化并重悬A549细胞及H1975细胞接种于6孔板中，分别使用NC及METTL5的干扰慢病毒按说明书进行转染，分为NC及shMETTL5组，72h后通过荧光显微镜观察荧光，重新铺板，加入5ug/ml嘌呤霉素，筛选METTL5敲低的稳转株；步骤2、临床数据分析首先在基因表达数据集(GEO)中搜索肺腺癌数据，下载数据集，分析METTL5表达情况，利用GEPIA根据METTL5的表达差异对肺腺癌患者进行生存分析，绘制Kaplan
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Meier生存曲线；步骤3、Western blot法检测；取经嘌呤霉素筛选后、镜下可见荧光的两组细胞，使用蛋白裂解液2
×
loading buffer裂解细胞提取蛋白，并在95℃条件下金属浴10min使蛋白边变性，吸取8μl样品加入上样孔中，使用140V电泳60min，200mA转膜90min，5％脱脂牛奶进行封闭，1h后TBST清洗PVDF膜3次，将PVDF膜与一抗室温孵育2h，TBST将PVDF膜清洗3次后放于HRP标记的Anti
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rabbit IgG二抗1:2000中孵育1h，TBST清洗后使用超敏发光液进行显影；步骤4、Transwell
TM
实验检测；检测迁移能力时，将处于对数生长期的NC组、shMETTL5组A549和H1975细胞消化并离心重悬，计数并将细胞浓度调节至1
×
105/ml，向上室中每孔加...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晔，王蕊红，徐峰，任继风，王婷婷，
申请(专利权)人：青岛市中心医院，
类型：发明
国别省市：