一种新鲜植物样品中油菜素甾醇的测定方法技术

本发明专利技术提供一种新鲜植物样品中油菜素甾醇的测定方法，包括如下步骤：(1)取研磨好的新鲜植物样品，加入一定量的油菜素甾醇同位素内标，然后加入溶剂提取液超声混匀、于4℃冰箱浸提过夜，得到油菜素甾醇提取液，并冷冻离心浓缩至干；(2)对步骤(1)所得的油菜素甾醇提取物复溶后，通过固相萃取柱除杂，用甲醇洗脱并收集，洗脱液冷冻离心浓缩至干，复溶并加入衍生化试剂进行衍生化反应，进而得到植物样品中油菜素甾醇的待测溶液，实现植物样品中油菜素甾醇的前处理；(3)将步骤(2)所得的油菜素甾醇待测溶液高速离心，通过液相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种新鲜植物样品中油菜素甾醇的测定方法


[0001]本专利技术属于植物激素测定
，具体涉及一种新鲜植物样品中油菜素甾醇(EBI、EBk、EBd)的测定方法。

技术介绍

[0002]油菜素甾醇(BRs)是一类内源植物生长促进激素，几乎存在于植物的各个部位，影响植物生命周期中的许多生理过程，包括促进细胞伸长和分裂、维管束分化、种子萌发、生根和花粉管形成、光形态建成以及植物结构等，还调节植物对生物和非生物胁迫的反应。但是它们在植物组织中的浓度极低，而且缺乏用于紫外或质谱检测的光敏、电敏或易电离基团，需要通过化学衍生化来提高其电离效率和检测灵敏度，因此BRs的分析是一项具有挑战性的工作。
[0003]已报道的油菜素甾醇测定方法存在仪器设备配置昂贵、合成衍生化试剂、样品前处理过程复杂和灵敏度低等问题。如[Xiang
‑
Yu Wang,Cai
‑
Feng Xiong,Tian
‑
Tian Ye,Jun Ding,Yu
‑
Qi Feng.Online polymer monolith microextraction with in
‑
situ derivatization for sensitive detection of endogenous brassinosteroids by LC
‑
MS.Microchemical Journal 158(2020):105061；Na An,Quan
‑<br/>Fei Zhu,Lei Yu,Yong
‑
Ting Chen,Sheng
‑
Li Chen,Yu
‑
Qi Feng.Derivatization assisted LC
‑
p
‑
MRM
‑
MS with high CID voltage for rapid analysis of brassinosteroids.Talanta.217(2020):121058；Fei
‑
feng Huo,Xin Wang,Ye
‑
hua Han,Yu Bai,Wei Zhang,Han
‑
cheng Yuan,Hu
‑
wei Liu.A new derivatization approach for the rapid and sensitive analysis of brassinosteroids by using ultra high performance liquid chromatography
‑
electrospray ionization triple quadrupole mass spectrometry.Talanta.,99(2012):420
–
425.]等。Xiang
‑
Yu Wang等研究的“在线富集与原位衍生技术”需要配备原位衍生和在线富集等昂贵的仪器设备，还需要自制在线富集柱；Na An等研究的方法需要合成衍生化试剂(rhodamine B
‑
boronic acid：RhB
‑
BA)；Fei
‑
feng Huo等研究的方法需要比较大的样品量(2g)和复杂的前处理。特别是大多数已报道的方法在样品验证时，发现测定得到的BRs的含量极低、甚至检测不到。而本专利技术只需要简单易操作的前处理步骤结合市场上现有衍生化试剂衍生化，通过普通的液相色谱
‑
三重四极杆质谱仪就可以精确检测出整株植物不同部位的BRs含量。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种新鲜植物样品中油菜素甾醇(EBI、EBk、EBd)的测定方法。
[0005]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0006]一种新鲜植物样品中油菜素甾醇的测定方法，包括如下步骤：
[0007](1)取研磨好的新鲜植物样品，加入油菜素甾醇同位素内标，然后加入溶剂提取液超声混匀、旋涡振荡，得到油菜素甾醇提取液，并冷冻离心浓缩至干，得第一油菜素甾醇提
取物；
[0008](2)对步骤(1)所得第一油菜素甾醇提取物使用第一复溶剂复溶后，通过固相萃取柱除杂，甲醇洗脱，收集洗脱液，冷冻离心浓缩至干，得第二油菜素甾醇提取物；
[0009](3)将步骤(2)第二油菜素甾醇提取物使用第二复溶剂复溶，并加入衍生化试剂超声反应2h，得到油菜素甾醇待测溶液，从而实现植物样品中油菜素甾醇的前处理；
[0010](4)将步骤(3)所得的油菜素甾醇待测溶液高速离心，通过液相色谱
‑
三重四极杆质谱仪进行检测；
[0011]进一步地，所述步骤(4)中，色谱条件为：色谱柱为岛津Shim
‑
pack XR
‑
ODSⅠ2.0mm I.D.
×
75mm,2.2μm C
18
柱，流动相A为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为甲醇；柱温为40℃；流速为0.25mL
·
min
‑1；进样体积为5μL。质谱条件为：电喷雾电离源，扫描方式为正离子扫描，检测方式为多反应监测；
[0012]进一步地，所述步骤(1)中的新鲜植物样品重量为100mg，所述溶剂提取液为100％的甲醇，所述新鲜植物样品与所述溶剂提取液的质量比为10:1；
[0013]进一步地，所述步骤(1)中的油菜素甾醇同位素内标为D
‑
BI([2H3]brassinolide)和D
‑
CS([2H3]castasterone)各8ng；
[0014]进一步地，所述步骤(2)中使用的复溶剂为50％的甲醇，体积为300μL；所述固相萃取柱为WatersVac 1cc(100mg)C18柱；进一步地，所述步骤(3)中的复溶剂为乙腈，体积为40μL；
[0015]进一步地，所述步骤(3)中的衍生化试剂为2mg
·
mL
‑1的4
‑
N,N
‑
二甲氨基苯硼酸(DMAPBA)；
[0016]进一步地，所述步骤(4)中离心力为15000g；
[0017]进一步地，所述步骤(4)中色谱条件为：色谱柱为岛津Shim
‑
pack XR
‑
ODSⅠ2.0mm I.D.
×
75mm,2.2μm C
18
柱；流动相A为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为甲醇；柱温为40℃；流速为0.25mL
·
min
‑1；进样体积为5μL。
[0018]进一步地，所述步骤(4)中质谱条件为：DL温度为200℃，Heat Block温度为400℃，Nebulizing Gas流速本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新鲜植物样品中油菜素甾醇的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取研磨好的新鲜植物样品，加入油菜素甾醇同位素内标和溶剂提取液超声混匀，浸提，得到油菜素甾醇提取液，并冷冻离心浓缩至干，得第一油菜素甾醇提取物；(2)对步骤(1)所得的第一油菜素甾醇提取物使用第一复溶剂复溶后，固相萃取柱除杂，用甲醇洗脱并收集，冷冻离心浓缩至干，得到第二油菜素甾醇提取物；(3)将所述第二油菜素甾醇提取物使用第二复溶剂复溶，同时加入衍生化试剂进行衍生化反应，得到油菜素甾醇的待测溶液；(4)将步骤(3)所述油菜素甾醇的待测溶液高速离心，通过液相色谱
‑
三重四极杆质谱仪进行检测。2.根据权利要求1所述的一种新鲜植物样品中油菜素甾醇的测定方法，其特征在于，所述步骤(1)溶剂提取液为100％的甲醇，所述新鲜植物样品与所述溶剂提取液的质量比为10:1。3.根据权利要求1所述的一种新鲜植物样品中油菜素甾醇的测定方法，其特征在于，所述步骤(1)中的油菜素甾醇同位素内标为2H3油菜素内酯和2H3油菜素甾酮，各8ng。4.根据权利要求1所述的一种新鲜植物样品中油菜素甾醇的测定方法，其特征在于，所述步骤(1)超声混匀后，放置于4℃冰箱浸提过夜。5.根据权利要求1所述的一种新鲜植物样品中油菜素甾醇的测定方法，其特征在于，所述步骤(2)中使用的第一复溶剂为50％的甲醇，体积为300μL；所述固相萃取柱为Waters Vac 1cc C
18
柱。6.根据权利要求1所述的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：童建华，肖浪涛，赵文魁，王刻铭，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：