本发明专利技术涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的异柠檬酸测定试剂（盒），同时本发明专利技术还涉及测定异柠檬酸浓度的方法、试剂的组成及成分，属于食品检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂（盒）主要成分包括：缓冲液、辅酶、谷氨酸、异柠檬酸裂解酶、甘氨酸转氨酶、甘氨酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度上升的程度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种异柠檬酸测定试剂(盒)，同时本专利技术还涉及测定异柠檬酸浓度的方法，属于食品检验测定
技术介绍
异拧檬酸isocitric acid是拧檬酸的异构体，虽然量少，但广泛存在于生物界。 在落地生根属(Bryophyllum)等多汁植物的叶、或悬钩子类中特别多，生物能够利用的是D 型。是三羧酸循环中的一个成分。柠檬酸在鸟头酸酶的作用下可逆地生成异柠檬酸和顺鸟 头酸。在异柠檬酸脱氢酶(EC 1. 1. 1.41 ;EC 1. 1. 1.42)的作用下变成a-酮戊二酸，在异 柠檬酸裂合酶(isocitrate lyase, EC4. 1. 3. 1)的作用下变成琥珀酸与乙醛酸。 中华人民共和国国家标准，GB T16771-1997，规定了橙、柑、桔汁及其饮料中D_异 柠檬酸的测定方法_紫外分光光度法。该方法适用于判定橙、柑、桔浓縮汁和果汁，以及果 汁含量不低于2. 5%的橙、柑、桔汁饮料的总D-异柠檬酸的测定。其测定原理异柠檬酸脱 氢酶isocitrate dehydrogenase有两种类型以NAD为辅酶的酶(EC1. 1. 1. 41)和要NADP 为辅酶的酶(EC1. 1. 1.42)，两者催化同一反应。 异柠檬酸+ NAD(P)倘oc-酮戊二酸+ C02 + NAP(P)H + f 在异柠檬酸脱氢酶催化下，样品中的D-异柠檬酸盐与NAD或NADP作用，生成NADH 或NADPH的含量，相当于D-异柠檬酸盐的量。在波长340nm处测定吸光度，确定样品中总 D-异柠檬酸的含量。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还 原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定异柠檬酸浓度的方法，同时，本专利技术还 将给出用以实现该方法的异柠檬酸测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分 析仪或半、全自动生化分析仪上进行异柠檬酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而 可以得到切实的推广应用。 本专利技术异柠檬酸浓度测定方法如下 异柠檬酸异柠檬酸裂解酶琥珀酸+乙醛酸 乙醛酸+谷氨酸甘氨酸转氨酶甘氨酸+2-酮戊二酸 甘氨酸+水+辅酶甘氨酸脱氡酶乙醛酸+氨+还原型辅酶 这种方法应用异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase ;EC 4. 1. 3. 1)酶(偶)联甘氨 酸转氨酶(glycine t:rans咖inEise ;EC 2. 6. 1. 4)、甘氨酸脱氢酶(glycine dehydrogenase; EC 1.4.1.10)酶促反应比色终点法。异柠檬酸裂解酶酶解异柠檬酸反应产生乙醛酸，再通 过(偶)联合甘氨酸转氨酶、甘氨酸脱氢酶的作用，最终将三个辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为三个还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm 处吸光度上升的程度，通过测量340nm处吸光度上升的程度，可以测算异柠檬酸的浓度大 小。 实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单 剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术异柠檬酸测定试剂(盒)较为理想 无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定异柠檬酸浓度的方法，其辅酶可以是 NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一种。具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。 实施例一 本实施例的异柠檬酸测定试剂为单试剂，包括 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500mmol/L 辅酶 3,1/L 异拧檬酸裂解酶 10000U/L 甘氨酸转氨酶 12000U/L 甘氨酸脱氢酶 12000U/L 谷氨酸 9mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净 水，复溶后使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37°C ，反应时间10分钟，起始吸光度《0. 1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测异柠檬酸样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。 实施例二本实施例的异柠檬酸测定试剂为双试剂，包括 试剂l三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 稳定剂 辅酶 100,1/L 50mmol/L 3mmol/L 9mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 稳定剂异拧檬酸裂解酶甘氨酸脱氢酶100,1/L 50mmol/L 10000U/L 12000U/L 12000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间10分钟，起始吸光度《0. 1， 测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测异柠檬酸样品与试剂1、试剂2的体积比例为 2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测 主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。 实施例三 本实施例的异柠檬酸测定试剂为三试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50mmol/L 辅酶 3,1/L 谷氨酸 9mmol/L 试剂2三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500mmol/L 甘氨酸转氨酶 12000U/L 甘氨酸脱氢酶 12000U/L 试剂3 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 lOOmmol/L 稳定剂 500mmol/L 异柠檬酸裂解酶 10000U/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定异柠檬酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间IO分钟，起始吸光度《0. 1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测异柠檬酸样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测 主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。 申请人:经过实验验证，采用以上
技术实现思路
中记载的其他测定方法均能达到本专利技术 的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。 总之，实验证明采用本专利技术的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所 需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.001 ;吸光度时间反应曲线应呈上 升曲线直至终点；试剂可测有效(R > 0. 99)线形范围可达15mmol/L ;试剂测试的不准确 度，其相对偏差不超过±3% ;试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《2% ;试剂 的灵敏度可达O. 015±0. 008 AA/mmol/本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酶比色法及酶联法的异柠檬酸的浓度测定方法，其方法如下： 异柠檬酸 异柠檬酸裂解酶 琥珀酸＋乙醛酸 乙醛酸＋谷氨酸 甘氨酸转氨酶 甘氨酸＋２－酮戊二酸 甘氨酸＋水＋辅酶 甘氨酸脱氢酶 乙醛酸＋氨＋还原型辅酶 将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度上升的程度，测算出异柠檬酸的浓度大小测定结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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