本发明专利技术涉及一种利用酶倍增法、酶比色法及酶联法技术的异柠檬酸测定试剂（盒），同时本发明专利技术还涉及测定异柠檬酸浓度的方法、试剂的组成及成分，属于食品检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂（盒）主要成分包括：缓冲液、辅酶、乙酰辅酶Ａ、过氧化氢、辅酶Ａ、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度上升的程度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种异柠檬酸测定试剂(盒)，同时本专利技术还涉及测定异柠檬酸浓度的方法，属于食品检验测定
技术介绍
异拧檬酸isocitric acid是拧檬酸的异构体，虽然量少，但广泛存在于生物界。 在落地生根属(Bryophyllum)等多汁植物的叶、或悬钩子类中特别多，生物能够利用的是D 型。是三羧酸循环中的一个成分。柠檬酸在鸟头酸酶的作用下可逆地生成异柠檬酸和顺鸟 头酸。在异柠檬酸脱氢酶(EC 1. 1. 1.41 ;EC 1. 1. 1.42)的作用下变成a-酮戊二酸，在异 柠檬酸裂合酶(isocitrate lyase, EC4. 1. 3. 1)的作用下变成琥珀酸与乙醛酸。 中华人民共和国国家标准，GB T16771-1997，规定了橙、柑、桔汁及其饮料中D_异 柠檬酸的测定方法_紫外分光光度法。该方法适用于判定橙、柑、桔浓縮汁和果汁，以及果 汁含量不低于2. 5%的橙、柑、桔汁饮料的总D-异柠檬酸的测定。其测定原理异柠檬酸脱 氢酶isocitrate dehydrogenase有两种类型以NAD为辅酶的酶(EC1. 1. 1. 41)和要NADP 为辅酶的酶(EC1. 1. 1.42)，两者催化同一反应。 异柠檬酸+NAD(P)+- a-酮戊二酸+C02 + NAP(P)H + H+ 在异柠檬酸脱氢酶催化下，样品中的D-异柠檬酸盐与NAD或NADP作用，生成NADH 或NADPH的含量，相当于D-异柠檬酸盐的量。在波长340nm处测定吸光度，确定样品中总 D-异柠檬酸的含量。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出 一 种利用酶倍增法(Enzymatic DoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法 (CoupleReaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处 吸光度的变化，得以测定异柠檬酸浓度的方法，同时，本专利技术还将给出用以实现该方法的异 柠檬酸测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析 仪上进行异柠檬酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本专利技术异柠檬酸浓度测定方法如下 异柠檬酸+辅酶异柠檬酸脱氡酶二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶 二氧化碳+过氧化氢+乙酰辅酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+辅酶A +氧 丙酮酸+辅酶A+辅酶丙酮酸脱氡酶二氧化碳+乙酰辅酶A+ 还原型辅酶这种方法应用异拧檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase ;EC 1.1.1.41;EC1. 1. 1. 42)酶(偶)联丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase ;EC 1. 2. 3. 6)、丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase ;EC 1. 2. 1. 51)酶促反应比色终点法。异柠檬酸脱氢酶酶解异 柠檬酸反应产生二氧化碳，再通过(偶)联合丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶的作用，最终二 次将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得 以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度，通过测量340nm处吸光度上升的程度，可 以测算异柠檬酸的浓度大小。 实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单 剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术异柠檬酸测定试剂(盒)较为理想缓冲液100,1/L稳定剂500,1/L辅酶3mmol/L异柠檬酸脱氢酶10000U/L丙酮酸氧化酶12000U/L丙酮酸脱氢酶12000U/L乙酰辅酶A7mmol/L过氧化氢12mmol/L辅酶A3mmol/L本专利技术的异柠檬酸邻!U定试剂(盒)可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、乙酰辅酶A、过氧化氢、辅酶A。 试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1 缓冲液、稳定剂、辅酶、乙酰辅酶A、过氧化氢、辅酶A。 试剂2 缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶。 辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、乙酰辅酶A、过氧化氢、辅酶A在试剂l或试剂2中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1 缓冲液、稳定剂、辅酶、乙酰辅酶A、过氧化氢、辅酶A。 试剂2 缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶。 试剂3 缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶。 辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、乙酰辅酶A、过氧化氢、辅酶 A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加 水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定异柠檬酸浓度的方法，其辅酶可以是 NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一种。具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。 实施例一本实施例的异柠檬酸测定试剂为单试剂，包括 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 辅酶异柠檬酸脱氢酶丙酮酸氧化酶丙酮酸脱氢酶乙酰辅酶A过氧化氢辅酶A500,1/L3mmol/L10000U/L12000U/L12000U/L7mmol/L12mmol/L 3mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净 水，复溶后使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间10分钟，起始吸光度《0. l，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测异柠檬酸样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。 实施例二 本实施例的异柠檬酸测定试剂为双试剂，包括 试剂1 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50mmol/L 辅酶 3mmol/L 乙酰辅酶A 7mmol/L 过氧化氢 12mmol/L 辅酶A 3mmol/L 试剂2三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50mmol/L 异柠檬酸脱氢酶 10000U/L 丙酮酸氧化酶 12000U/L 丙酮酸脱氢酶 12000U/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。6 在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间10分钟，起始吸光度《0. 1， 测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测异柠檬酸样品与试剂1、试剂2的体积比例为 2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测 主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。 实施例三本实本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酶倍增法、酶比色法及酶联法的异柠檬酸的浓度测定方法，其方法如下： 异柠檬酸＋辅酶 异柠檬酸脱氢酶 二氧化碳＋酮戊二酸＋还原型辅酶 二氧化碳＋过氧化氢＋乙酰辅酶Ａ 丙酮酸氧化酶 丙酮酸＋辅酶Ａ＋氧 丙酮酸＋辅酶Ａ＋辅酶 丙酮酸脱氢酶二氧化碳＋乙酰辅酶Ａ＋还原型辅酶 将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度上升的程度，测算出异柠檬酸的浓度大小测定结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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