本发明专利技术公开了一种抗猪肺炎支原体ＳＩｇＡ间接ＥＬＩＳＡ检测方法，涉及生物检测技术领域。主要经由抗原预包被条制备、酶结合物制备、其它试剂的配制、检测。利用羊抗猪ＩｇＡ结合已与固相猪肺炎支原体Ｐ９７Ｒ１蛋白抗原结合的受检测猪肺炎支原体ＳＩｇＡ，再通过辣根过氧化物酶标记的兔抗羊ＩｇＧ结合羊抗猪ＩｇＡ，最终检测待检样品中猪肺炎支原体ＳＩｇＡ抗体。其检测方法灵敏度高、特异性强，操作方法简便易行，可以标准化为产品，用于肺炎猪支原体感染的临床检测、流行病学调查和主动免疫效果检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测
特别是涉及抗猪肺炎支原体SIgA间接ELISA的检 测方法。用于猪肺炎支原体感染临床检测、流行病学调查及免疫监测。
技术介绍
猪肺炎支原体(Mycqp/a，a/z"/7朋wmom'ae， Mj; )是引起猪气喘病(MPS)的病 原。后者是猪群中流行最广、传播最快、最难净化的疫病之一。猪肺炎支原体通过呼 吸道传播，感染呼吸道上皮后导致呼吸道纤毛萎縮、脱落、损坏，上皮细胞坏死，降 低呼吸道粘膜的免疫功能，引起肺部功能损伤，容易产生其它呼吸道病原的继发感 染。研究表明，对MPS的预防主要通过呼吸道局部的细胞免疫和粘膜免疫。slgA是参 与粘膜免疫反应的主要效应因子。它们是机体免疫系统中的重要组成部分，在免疫应 答中分别起着重要作用。SIgA能够抗病毒、中和毒素及其它生物活性抗原，具有广泛 的免疫保护作用，伹最主要的保护作用是阻止细菌对上皮细胞表面粘附，并清除入侵 的病原。它也是病原体侵入后最先产生的免疫反应，因此，常根据特异性IgA的检测作 疾病的早期诊断。抗猪肺炎支原体IgA是M^感染或免疫后在呼吸道首先产生的特异性 标志，同时也反映了疫苗免疫后的保护效果。猪肺炎支原体的诊断方法包括病原检测和血清抗体检测。病原检测方法包括病 原的分离与鉴定，聚合酶链式反应(PCR)、实时定量PCR和原位杂交法等。这些方 法虽都有各自的优点，但也存在耗时较长、检测难度大、检测结果不确定性、所需设 备条件和不适合活体检测等缺点。血清抗体检测方法包括微量间接血凝试验(IHA)和酶联免疫吸附试验 (ELISA)等。但是，IHA的检测中存在着检测滴度低、结果与感染的相关性低、凝 集终点判定的主观性较强以及本身固有的技术缺陷等问题，因此IHA在商品猪群的 M p检测中实际应用前景有限。ELISA是目前应用最广泛的检测技术。它具有敏感、 特异和快速的特点，且需要的技术和设备要求也不高，非常适用于目前的生产实际。然而，目前所用的ELISA方法均是用来检测Jkft; IgG抗体。由于猪肺炎支原体感 染后，IgG抗体产生相对较慢；且研究表明，全身的体液免疫对该病原的免疫保护作用 不大。相反，呼吸道局部产生的黏膜免疫和细胞免疫能产生较好的免疫保护效果。因 此，建立SIgA的ELISA检测方法更适用于该病的早期诊断与主动免疫后免疫指标的监P97R1是M^粘附素P97蛋白的一个重复单元。R1区是P97蛋白产生粘附能力的主 要功能区。M p通过粘附感染猪支气管纤毛上皮细胞，继而产生后续的致病作用。机体针对支原体的粘附能迅速产生相应的粘膜免疫反应。若利用P97R1蛋白作为包被原 能在感染后第一时间检测到相应的SIgA反应，适合于该病的早期诊断。且P97蛋白具有种属特异性，与其它猪支原体不存在血清学交叉干扰。
技术实现思路
技术问题针对上述领域中的缺陷，本专利技术提供了一种抗猪肺炎支原体SIgA间接ELISA的检 测方法，其抗原制备工艺简单、生物安全度高、成本低廉、易于生产和应用等特点， 为进一步开发与研究猪肺炎支原体SIgA抗体检测试剂盒奠定基础。技术方案一种抗猪肺炎支原体SIgA的间接ELISA检测方法，其包被抗原为由大肠杆菌原核表 达的猪肺炎支原体P97R1蛋白，以猪肺脏灌洗液或鼻拭子为检测样品，以羊抗猪IgA为 二抗，以辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG为酶标三抗进行检测猪肺炎支原体SIgA抗 体。包括，1) ELISA检测用试剂及溶液(1) 羊抗猪IgA抗体(2) 辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG(3) 包被液即碳酸盐缓冲液NaC03 1.59g， NaHC03 2.93g，加蒸馏水定容至 1000mL，调pH值到9.6;(4) 磷酸盐缓冲液即0.01M PBS: NaCl 8.0g， KC1 0.2g， KH2P04 0.2g， Na2HP04 12H20 2.9g，加蒸馏水定容至1000mL，调pH值至(j7.4;(5) 封闭液lg牛血清白蛋白BSA用磷酸盐缓冲液定容至100mL;(6) 洗涤液含有0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液；(7) 稀释液0.01M, pH7.4磷酸盐缓冲液；(8) 底物缓冲液0.2mol/LNa2HPO4:取Na2HPCU 12H20 14.33g，加蒸馏水150mL，完全溶解后， 定容至200mL;0.1mol/L拧檬酸取拧檬酸0.84g，加蒸馏水150mL，完全溶解后，定容至200mL;(9) 底物显色液四甲基联苯胺TMB底物显色液；(10) 终止液即2M H2S04: 21.7mL浓硫酸缓慢加入178.3mL蒸馏水中；2) 阴阳性标准品的釆集(1)以M p阴性母猪所产3-5日龄仔猪的肺脏灌洗液或鼻拭子为阴性标准品；(2) 以经猪支原体肺炎活疫苗168株两次肺内免疫后的仔猪肺脏灌洗液或鼻拭子为阳性标准品；(3) 猪肺脏灌洗液的采集方法将猪剖杀后，通过气管向肺脏内灌入50 ml灭菌生理盐 水，按摩肺脏15s，收集灌洗液约10ml，将灌洗液于低温1000-5000rpm离心 10min,收集上清作为检测样品，于-20 'C冻存备用；(4) 猪鼻拭子样品的采集用棉签采集猪两鼻孔拭子，将拭子于lmL灭菌生理盐水中 于4。C浸泡过夜，挤干后取出，浸泡液于低温1000-5000rpm离心10min，收集上清 作为检测样品，于-2(TC冻存备用；3) 检测样品的准备检测样品为肺脏灌洗液或鼻拭子，具体采集方法同阴阳性标准品的采集；4) ELISA操作方法(1) 包被用包被液将权利要求l所述P97Rl蛋白稀释成l-25pg/mL，包被ELISA板，每 孔加100uL，于37。C温育2h后，再放入4。C过夜，倒出孔内液体，加入200yL/孔 洗涤液，每次3min，拍干，重复洗涤3次；；(2) 封闭每孔加入封闭液20(HiL，于37。C封闭2h，倒出孔内液体，洗涤3次；封闭液 为lg牛血清白蛋白BSA用磷酸盐缓冲液定容至100mL;(3) 加检测样品每孔加入100pL检测样品，另设两个阴性标准孔和两个阳性标准孔， 于37'C温育2h，倒出孔内液体，洗涤3次；(4) 加二抗每孔加入100nL经稀释液l:1000-l:10000稀释的羊抗猪IgA抗体，于37"C温 育lh，倒出孔内液体，洗涤3次；(5) 加酶标三抗每孔加入经稀释液1:5000-1:20000稀释的100)aL辣根过氧化物酶标记 兔抗羊IgG，于37'C温育lh，倒出孔内液体，洗涤5次；(6) 加显色液每孔加入100nL新鲜配制的TMB显色液，于37。C避光作用10min;(7) 终止每孔加入50pL终止液，酶标仪检测450nm处OD值；(8) 结果判定样品中SIgA效价用S/P值确定，S/P=(检测样品OD值-阴性标准品OD值)/ (阳性标准品OD值-阴性标准品OD值)， S/P值X).15判为阳性； S/P值0.1判为阴性； 当0.KS/PO.15时，判为疑似。有益效果本专利技术中所用的包被抗原P97R1是利用引物定点突变PCR方法，扩增猪肺炎支原体黏附因子P97的抗原决定簇R1区段，将Rl区基因插入表达载体pET-32(+)中构建重组 质粒pET-32(+)-P97 (Rl)，再将该重组质粒转入大肠杆菌BL21中进行本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗猪肺炎支原体ＳＩｇＡ的间接ＥＬＩＳＡ检测方法，其包被抗原为由大肠杆菌原核表达的猪肺炎支原体Ｐ９７Ｒ１蛋白，以猪肺脏灌洗液或鼻拭子为检测样品，以羊抗猪ＩｇＡ为二抗，以辣根过氧化物酶标记的兔抗羊ＩｇＧ为酶标三抗进行检测猪肺炎支原体ＳＩｇＡ抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：冯志新，逯晓敏，邵国青，刘茂军，甘源，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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