两株三氯乙烯同化降解菌及其应用制造技术

本发明专利技术属于环境微生物技术领域，具体公开了两株三氯乙烯同化降解菌Cytobacillus oceanisediminis SH48和Lysinibacillus fusiformis SH13及其应用。Cytobacillus oceanisediminis SH48和Lysinibacillus fusiformis SH13菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCC M 2023370和CCTCC M2023371，保藏日期为2023年3月21日，两株菌株生长对环境条件要求低，能够在不添加额外生长基质的条件下以三氯乙烯为自身生长所需的唯一碳源与能源，有效降解氯代烃污染物，释放无机游离氯离子且无毒性中间产物积累，该菌株或由其制备的微生物菌剂可用于氯代烃污染的工业污染场地的土壤或地下水的生物修复，具有重要应用前景。具有重要应用前景。具有重要应用前景。

【技术实现步骤摘要】
SH13菌株的筛选方法，包括以下步骤：
[0010]S1.厌氧富集：在三氯乙烯污染的场地采集土壤样品，将土壤样品加到无菌水中混合，并外源添加三氯乙烯和甲醇作为刺激剂对菌群进行厌氧条件下的富集培养，期间补加三氯乙烯；
[0011]S2.分离纯化：用梯度稀释法获得富集土壤的梯度稀释悬液，并涂布在添加乙酸盐、三氯乙烯和甲醇的无机盐固体培养基上，在有氧条件下进行分离培养，生长出的单菌落进行划线纯化，得到多个纯化的菌株；
[0012]S3.分子鉴定：将步骤S2中分离得到的菌株提取DNA，并进行ERIC
‑
PCR分型，挑选代表性菌株进行16S rRNA基因全长片段的PCR扩增与测序，利用NCBI数据库经Blast比对鉴定其分类地位；
[0013]S4.降解试验：将鉴定过的菌株分别接入以三氯乙烯为唯一碳源的无机盐基本液体培养基中培养，培养结束后通过生长状态、检测培养液顶空中的三氯乙烯含量以及培养液中氯离子释放量来筛选出可有效降解三氯乙烯的菌株。
[0014]本专利技术的目的之二是提供上述Cytobacillus oceanisediminis SH48菌株和Lysinibacillus fusiformis SH13菌株在降解氯代烃中的应用，该菌株或由其制备的微生物菌剂可用于三氯乙烯等氯代烃污染的工业污染场地的土壤或地下水的生物修复。
[0015]本专利技术具有以下有益效果：
[0016]Cytobacillus oceanisediminis SH48和Lysinibacillus fusiformis SH13菌株来源于氯代烃污染场地的原位土壤环境，都能实现氯代烃的同化降解，是第一次报道Cytobacillus和Lysinibacillus属的氯代烃异养同化菌。两株菌株均能够在不添加额外生长基质的条件下利用三氯乙烯，对其进行降解的同时进行生长代谢，菌株生长对环境条件要求宽松且对营养需求低，而且降解过程无毒性中间产物的积累，实际应用中不会对场地造成二次污染，因此在生物修复氯代烯烃污染的工业场地具有较好的应用前景。
附图说明
[0017]图1：实施例中Cytobacillus oceanisediminis SH48菌株(A)和Lysinibacillus fusiformis SH13菌株(B)的菌落形态。
[0018]图2：实施例中Cytobacillus oceanisediminis SH48菌株(A)和Lysinibacillus fusiformis SH13菌株(B)的细胞显微形态(1000
×
)。
[0019]图3：实施例中Cytobacillus oceanisediminis SH48菌株和Lysinibacillus fusiformis SH13菌株与数据库中其它同种属菌株的系统发育关系树图。
[0020]图4：实施例中Cytobacillus oceanisediminis SH48菌株和Lysinibacillus fusiformis SH13菌株在含三氯乙烯的无机盐基本液体培养基生长过程中的三氯乙烯和氯离子的动态变化图。
[0021]图5：实施例中两株菌株在含三氯乙烯的无机盐基本液体培养基中培养前和培养后的流式细胞仪计数结果。图中，A表示未接菌的含TCE的空白培养基对照；B表示Lysinibacillus fusiformis SH13菌株培养的初始时刻；C表示Lysinibacillus fusiformis SH13菌株培养的结束时刻；D表示Cytobacillus oceanisediminis SH48菌株培养的初始时刻；E表示Cytobacillus oceanisediminis SH48菌株培养的结束时刻。
具体实施方式
[0022]以下结合附图和具体实施例对本专利技术进行进一步的说明。
[0023]实施例
[0024]本实施例筛选出了海洋沉积物纤维芽孢杆菌Cytobacillus oceanisediminis SH48和纺锤形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis SH13两株三氯乙烯同化降解菌，具体过程如下：
[0025]一、培养基配制
[0026]按以下配方配制所需培养基及相关试剂：
[0027](1)无机盐固体培养基：0.2g/L(NH4)2SO4、0.62g/L MgSO4·
7H2O和0.023g/L CaSO4·
2H2O、0.82g/L磷酸盐缓冲液、0.82g/L乙酸钠、0.5g/L酵母提取物、14g/L琼脂，121℃高温高压灭菌；灭菌后加入1mL/L微量元素溶液A、1mL/L微量元素溶液B、5mL 200
×
维生素母液、100μM TCE和202μL/L甲醇；
[0028](2)无机盐基本液体培养基：0.2g/L(NH4)2SO4、0.62g/L MgSO4·
7H2O和0.023g/L CaSO4·
2H2O、0.82g/L磷酸盐缓冲液，121℃高温高压灭菌20min。灭菌后加入1mL/L微量元素溶液A、1mL/L微量元素溶液B和5mL/L 200
×
维生素母液和100μM TCE；
[0029](3)磷酸盐缓冲液：0.348g/L K2HPO4和0.262g/L KH2PO4使用0.22μm滤膜过滤后保存；
[0030](4)微量元素溶液A：10mL/L HCl(25％，w/w)、1.5g/L FeCl2·
4H2O、0.19g/L CoCl2·
6H2O、0.1g/L MnCl2
·
4H2O、70mg/L ZnCl2、6mg H3BO3、36mg/LNa2MoO4·
2H2O、24mg/L NiCl2·
6H2O、2mg/L CuCl2·
2H2O，121℃高温高压灭菌20min；
[0031](5)微量元素溶液B：6mg/L Na2SeO3·
5H2O、8mg/L Na2WO4·
2H2O、0.5g/LNaOH，121℃灭菌20min；
[0032](6)200
×
维生素母液：20mg生物素、20mg叶酸、100mg盐酸吡哆醇、50mg核黄素、50mg硫胺素、50mg烟酸、50mg泛酸、1mg维生素B12、50mg对氨基苯甲酸、50mg硫辛酸溶于1L纯水中，用NaOH将pH值调节到7.5，得到1000
×
维生素储备液，再以纯水稀释5倍得到200
×
维生素母液，使用前用0.22μm滤膜过滤灭菌；
[0033](7)TSA培养基：15g/L酪蛋白胨、5g/L大豆蛋白胨、5g/L NaCl、15g/L琼脂，121℃灭菌20min。
[0034]二、菌株的筛选方法
[0035]按以下步骤进行菌株的筛选：
[0036]S1.厌氧富集：在苏州一三氯乙烯与苯混合污染的工业本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株三氯乙烯同化降解菌，其特征在于：该菌为海洋沉积物纤维芽孢杆菌Cytobacillus oceanisediminis SH48，保藏编号为：CCTCC M 2023370，16SrRNA序列如SEQ ID NO:1所示。2.一株三氯乙烯同化降解菌，其特征在于：该菌为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis SH13，保藏编号为：CCTCC M 2023371，16S rRNA序列如SEQ ID NO:2所示。3.权利要求1或2所述的三氯乙烯同化降解菌的筛选方法，包括以下步骤：S1.厌氧富集：在三氯乙烯污染的场地采集土壤样品，将土壤样品加到无菌水中混合，并外源添加三氯乙烯和甲醇作为刺激剂对菌群进行厌氧条件下的富集培养，期间补加三氯乙烯；S2.分...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓君，张蕾，杨楷文，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：