一种高负荷异养反硝化菌剂的生产工艺制造技术

本发明专利技术是一种高负荷异养反硝化菌剂的生产工艺，本发明专利技术的特点是通过利用高通量测序技术迅速筛选高菌种丰度的目标菌源，利用人工富集的方法快速提高反硝化功能菌的丰度，使其在筛菌过程中具有生长优势，通过平板划线分离及多种培养基结合的方法选出底物亲和力高、脱氮速率快、传代时间短的全程异养反硝化菌株，并利用响应曲面的方法进行菌种复配，并根据需求确定菌剂的实际用量，适用于含有硝态氮和亚硝态氮的废水脱氮。态氮的废水脱氮。态氮的废水脱氮。

【技术实现步骤摘要】
一种高负荷异养反硝化菌剂的生产工艺


[0001]本专利技术属于水处理应用领域，具体涉及一种高负荷异养反硝化菌剂的生产工艺。

技术介绍

[0002]随着工业的发展，水体污染的情况越来越严重，其中氮素污染占据相当大的比例。
[0003]目前化工行业常用的脱氮工艺为SBR或A/O工艺：SBR反应器脱氮效率低，脱氮负荷一般为0.02
‑
0.06 kgN/(m3·
d)；而A/O工艺由于废水碳氮比低的原因，脱氮效果不理想，总氮去除率一般为70%左右。现阶段大多数的污水厂构筑物只能将污水TN降低到15 mg/L，而随着城市污水排放标准的进一步提高，进一步降低出水TN成为技术难点。为了高效快速的解决总氮小于15 mg/L的废水脱氮，并使出水小于1.5 mg/L，需要筛选高效反硝化细菌。
[0004]传统的筛选方法依靠培养基进行培养，分离，生化鉴定及计数的微生物研究方法，操作繁琐，速度较慢，无用功概率高。
[0005]Illumina公司的新一代测序仪准确性高，具有高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优势，可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。
[0006]筛选反硝化菌株的实验原理是反硝化菌株能在含有硝态氮的培养基上生长，在该培养基上其他种类微生物的生存则较为不利，而得以快速分离纯化目标菌株。
[0007]反硝化细菌群落简单地分为两类：仅将硝酸盐还原为亚硝酸盐并导致亚硝酸盐积累的“硝酸盐呼吸”细菌，以及能够还原硝酸盐到氮气的“真正的反硝化菌”细菌。利用Giltay培养基法筛选菌株，培养基颜色由绿变为蓝，说明可以进行硝酸盐还原为亚硝酸盐的步骤。而亚硝酸盐进一步还原成氧化亚氮或氮气时，则可以在培养基中观察到产气现象。
[0008]将以上两个方法结合起来，可以高效、快速的筛选出反硝化细菌丰度高的泥源，同时结合反硝化实验结果，剔除反硝化性能差的污泥样本，提高反硝化菌株筛选效率。
[0009]目前常用筛菌方法基本遵从采样
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分散
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平板划线
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提纯
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逐级放大
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复配
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使用的流程，整个流程不确定性高，需要人工的操作量大，而专利CN104450592A公开了一种基于生物多样性信息分离反硝化脱硫细菌的方法，虽然也使用了高通量测序的方法，但是高通量测序的主要目的为提供特定反应器的生态分布信息，且为各种菌株均提供了相应的培养基，使筛出的菌株在实际环境中的竞争力降低，可能导致产品研发失败。
[0010]本专利技术的目的是提供一种高负荷异养反硝化菌剂的生产工艺，主要方法是通过高通量测序筛选出反硝化细菌丰度高的污泥，并辅以反硝化动力学筛选出高反硝化细菌丰度，高反硝化负荷的污泥，利用人工富集的方法进一步提高污泥的反硝化能力，同时利用实际废水等多种培养基相结合，筛选出反应速率高，生长速度快，可直接适用于实际废水的全程反硝化菌株。并利用响应曲面的方法对菌株进行复配，剔除互相负影响的菌株，制成高负荷菌剂。与传统菌剂研发方法相比，本专利技术的菌剂筛选方法针对性强，成功率高，并可根据实际项目定制高效异养反硝化菌剂，同时减少了操作人员的工作量，整体流程简便，快速。

技术实现思路

[0011]针对常规菌剂开发过程中的菌剂开发流程长，产品不稳定等问题，结合上述技术背景，本专利技术提供了一种菌剂的生产工艺，主要利用高通量测序技术和人工富集相结合，同时利用选择性培养基选择出符合筛选要求的高性能菌株。
[0012]为达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术所述生产工艺包括优秀泥源筛选，反硝化菌株筛选，反硝化菌剂复配和菌剂制作。具体步骤如下：（1）优秀泥源筛选：利用高通量测序技术和反硝化动力学的方法筛选出反硝化菌丰度高且反硝化负荷大于0.02 kgN/(kgSS
·
d)的目标泥源；（2）反硝化菌株筛选：使用人工富集的方法，利用人工配水进一步提高目标菌源低浓度反硝化的能力；利用低浓度的反硝化细菌固体培养基和Giltay培养基筛选全程反硝化细菌；使用低浓度反硝化细菌液体培养基筛选出生长速度快、反应速率高、处理效果好的几种反硝化菌株；（3）反硝化菌剂复配：利用响应曲面的试验方法将筛选出的菌株进行复配，配置出比所有单菌负荷都要高的复合反硝化菌剂；（4）菌剂制作：将上述复合反硝化菌剂扩大生产，并判断其传代稳定性。
[0013]所述的工艺可用于筛选反硝化菌株，具体处理对象为含有硝态氮和亚硝态氮的废水。
[0014]所述步骤（1）中利用高通量测序技术可将污泥样品送至专门进行生物测序的公司，生物测序公司可选择生工生物工程（上海）有限公司、上海派森诺生物科技股份有限公司、美吉生物集团、基迪奥生物、华大基因、北京博莱明创生物技术有限公司、北京华大中生科技发展有限公司、北京斯克尔基因生物技术有限公司、百替生物等进行提供高通量服务的公司，也可使用试剂盒自行进行检测。
[0015]所述步骤（1）中所述的反硝化菌属丰度高指的是现有研究中已经报道过的具有反硝化功能的菌属丰度之和高，优选Pseudomonas，Flavobacterium，Methyloversatilis，Methylotenera，Hyphomicrobium，Thiothrix，Hydrogenophaga，Comamonas的丰度之和高。
[0016]所述步骤（2）中人工配水的水质为：使用污水厂的二沉池出水，并根据C/N=3
‑
8的比例投加碳源。
[0017]所述步骤（2）中泥源的反硝化能力应提高至当污泥浓度为2000
‑
5000 mg/L，容积负荷达到0.4 kgN/(m
³
·
d)以上时。
[0018]所述步骤（2）中低浓度反硝化细菌固体培养基是指目标污水厂的二沉池出水，并根据C/N=3
‑
8的比例投加碳源，同时加入1%
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2%的琼脂制成的固体培养基。低浓度反硝化细菌液体培养基指的是上述配置方法未添加琼脂的培养基。
[0019]所述的碳源优选为中国专利202110612710.X公开的复合碳源，由以下组分组成：0%~5%甲醇，0%~5%乙醇，5%~30%乙酸钠，0%~5%葡萄糖，0.1%~2%糖蜜，1%~5%的腐殖酸发酵液，其余为水；其中，腐殖酸发酵液COD为1~8万mg/L。
[0020]所述步骤（2）中选出的全程反硝化细菌指的是可以让Giltay培养基变色及发生产气现象的细菌。
[0021]所述步骤（2）中使用生长动力学和反硝化动力学筛选出生长速度快、反应速率高、
处理效果好的反硝化菌株的方法为：使用实际废水培养基、Giltay培养基和生长动力学筛选出同时满足可以让Giltay培养基变色及发生产气现象，同时满足处理1
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10批次配水后OD600增量大于0.05、OD600在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高负荷异养反硝化菌剂的生产工艺，其特征在于：所述工艺具体包括如下步骤：（1）优秀泥源筛选：利用高通量测序技术和反硝化动力学的方法筛选出反硝化菌属丰度高且反硝化负荷大于0.02 kgN/(kgSS
·
d)的目标泥源；（2）反硝化菌株筛选：使用人工富集的方法，利用人工配水进一步提高目标菌源的反硝化的能力；利用低浓度的反硝化细菌固体培养基和Giltay培养基筛选全程反硝化细菌；使用低浓度反硝化细菌液体培养基筛选出生长速度快、反应速率高、处理效果好的反硝化菌株；（3）反硝化菌剂复配：利用响应曲面的试验方法将筛选出的菌株进行复配，配置出比所有单菌株负荷都要高的复合反硝化菌剂；（4）菌剂制作：将上述复合反硝化菌剂扩大生产并判断其传代稳定性。2.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述的反硝化菌剂的处理对象为含有硝态氮和亚硝态氮的废水。3.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，步骤(1)中所述的反硝化菌属丰度高具体指的是Pseudomonas，Flavobacterium，Methyloversatilis，Methylotenera，Hyphomicrobium，Thiothrix，Hydrogenophaga，Comamonas的丰度之和高。4.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述目标泥源的污泥负荷大于0.02 kgN/(kgSS
·
d)。5.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述人工富集的方法具体如下：利用污水厂的二沉池出水，并根据C/N=3
‑
8的比例投加碳源，将目标菌源的反硝化能力提高到污泥浓度在2000
‑
5000 mg/L时，容积负荷为0.4 kgN/(m
³
·
d)以上。6.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述分离纯化反硝化细菌的方法为：利用目标污水厂的二沉池出水，根据C/N=3
‑
8的比例投...

【专利技术属性】
技术研发人员：李海松，阎登科，许子聪，田敏慧，胡培基，
申请(专利权)人：知和环保科技有限公司，
类型：发明
国别省市：