一种包含人NGLY1基因的重组质粒、工程菌以及人工NGLY1的制备方法和检测方法技术

本发明专利技术涉及人NGLY1基因和人工NGLY1技术领域，尤其涉及一种包含人NGLY1基因的重组质粒、工程菌以及人工NGLY1的制备方法和检测方法，一种检测人工基因突变体NGLY1活性的检测方法，包括以标准N

【技术实现步骤摘要】
一种包含人NGLY1基因的重组质粒、工程菌以及人工NGLY1的制备方法和检测方法


[0001]本专利技术涉及人NGLY1基因和人工NGLY1
，尤其涉及一种包含人NGLY1基因的重组质粒、工程菌以及人工NGLY1的制备方法和检测方法。

技术介绍

[0002]蛋白质N
‑
糖基化是真核生物最常见的一种翻译后修饰，参与维持N
‑
糖蛋白的结构与功能，并且与肿瘤、感染和免疫疾病等相关；N
‑
糖苷酶具有对N
‑
糖蛋白去糖基化的作用，在真核生物中广泛分布，人N
‑
糖苷酶简称为NGLY1，NGLY1参与清除细胞内错误折叠的N
‑
糖蛋白，能完整切割糖蛋白或者糖肽上的N
‑
糖链，当编码NGLY1基因出现突变并且影响到产生的NGLY1活性的时候，人体内糖蛋白和糖肽的N
‑
糖链代谢就会受到严重影响，引起一系列相关症状，由于不是所有突变能会产生NGLY1活性的变化，因此对NGLY1活性的检测结果对疾病的诊断、预测病情进展，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
rpm，培养时间为10
‑
12 h，IPTG为0.5~2mmol/L，温度为25~30℃，诱导时间为12~18 h；步骤二菌体量100
‑
300ml，10
10
‑
10
12 CFU/ml，裂解液10~15ml，溶菌酶用量50
‑
200μg/ml，冰上孵育时间为30~60min；步骤三超声功率为100~300W；步骤四离心温度为0~4℃，速度为8000~12000 rpm；步骤五摇床温度为0~4℃；步骤八保存温度为
‑
80~
‑
20℃。6.一种检测权利要求5所述的制备方法制备的人工基因突变体NGLY1活性的检测方法，其特征在于，包括以标准N
‑
糖蛋白RNase B为底物，以人工正常NGLY1为对照，具体步骤如下：步骤1）底物变性：将RNase B置于恒温金属浴中，80
‑
100℃，5
‑
10 min使RNase B变性；步骤2）酶切反应：1~2 μg热变性后的RNase B冷却至室温后，分别加入1~2 μg纯化后的人工基因突变体NGLY1和对照组的人工正常NGLY11
‑
2μg/μL，定容20~30 μL，在35~37℃下水浴反应8
‑
12 h；步骤3）取反应产物用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法SDS
‑
PAGE及质谱MALDI
‑
TOF
·
MS鉴定。7.一种用权利要求5制备方法制备的人工正常NGLY1，其特征在于，所述人工正常NGLY1能将人血清中的有高甘露糖型糖链或复合型糖链的N
‑
糖蛋白通过水解的方式完整去糖基化...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙桂芹，陈力，袁舒颖，陈妍雯，
申请(专利权)人：浙江中医药大学，
类型：发明
国别省市：