一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法，涉及生物检测领域，所述方法步骤包括如下：S1：材料准备，S2：细胞复苏，S3：细胞培养，S4：实验分组，S5：RIP检测PCIRBP调控TP53，该一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法，抗体浆表达在胰腺癌的表达显著低于癌旁组织，抗体癌浆核表达和胰腺癌病人的肿瘤大小显著负相关，抗体癌旁浆表达和胰腺癌病人的糖尿病史显著负相关，即无糖尿病史的亚组的抗体浆表达显著更高，抗体癌核高表达的胰腺癌病人的总生存期显著更好，数据库查询目标基因表达高的胰腺癌的生存期显著更好抑癌。显著更好抑癌。显著更好抑癌。

【技术实现步骤摘要】
一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法


[0001]本专利技术涉及生物检测领域，具体为一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法。

技术介绍

[0002]RIP技术(RNABindingProteinImmunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀)，是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA
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蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析；即用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白，防止非特异性的RNA的结合，免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来，结合的RNA序列通过microarray(RIP
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Chip)，定量RT
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PCR或高通量测序(RIP
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Seq)方法来鉴定；目标蛋白是一种应激反应蛋白，在应激反应过程中，可以从细胞核迁移到细胞质，此外，目标蛋白还可以从细胞中分泌出来，在细胞外作为损伤相关分子模式发挥功能，促进炎症反应，并在急性和慢性炎症中发挥重要作用。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供了一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法，所述方法步骤包括如下：
[0004]S1：材料准备，准备试剂细胞培养试剂：胎牛血清，DMEM
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高糖培养基，RPMI
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1640培养基，青链霉素，PBS磷酸钾缓冲液，Trypsin/>‑
EDTA(0.25％)phenol red以及实验耗材6孔板细胞培养板，12孔板细胞培养板，24孔板细胞培养板，48孔板细胞培养板，96孔板细胞培养板，巴氏吸管；
[0005]S2：细胞复苏，将水浴锅预热至37℃，用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面，在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等，取出冻存管，迅速解冻，迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，在冻存管内还存在一点点没融化的时候，取出，用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内，制备细胞悬液，将细胞转移至一个15ml离心管内，一滴一滴地加入预热好的培养基，同时一边晃动离心管；加入培养基的量要达到10ml以上，离心，在低速离心机上，以800rpm离心5分钟；吸去上清，然后用1ml培养基重悬细胞，将细胞悬液分装入培养皿内，将培养皿放入37℃含CO2的培养箱内培养，换液的时间由细胞沉降速度情况而定；
[0006]S3：细胞培养，将水浴锅预热至37℃，用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面，在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等，取出细胞培养瓶，无菌操作，打开瓶盖，吸掉旧培养液，用PBS洗涤细胞一至二次，加入trypsin
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EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，轻洗细胞皿底部，吸掉trypsin
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EDTA溶液，放入37℃培养箱2
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3分钟，轻拍培养瓶壁使大部分细胞脱落，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用；
[0007]S4：实验分组，检测项目为RIP检测CIRBP调控TP53、、PCR检测CIRBP、TP53、wb、CIRBP、ACSL4、PTGS2、NOX1、GPX4、FTH1、普鲁士蓝染色、激光共聚焦检测线粒体活性氧ROS、谷胱甘肽GSH检测、流式凋亡检测、细胞增殖生长曲线检测；
[0008]S5：RIP检测P CIRBP调控TP53。
[0009]优选的，所述步骤S4中实验流程为：a：细胞裂解液获取；b：磁珠的准备；c：染色质剪切；d：RNA结合蛋白免疫沉淀；e：RNA纯化。
[0010]优选的，所述S4中R PCR检测CIRBP、TP53步骤为：样本总RNA提取、三步法荧光定量RT
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PCR反应、荧光定量PCR反应、荧光定量RT
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PCR数据分析。
[0011]优选的，样本总RNA提取步骤为取适当样本材料液氮研磨后加入1000ul Trizol充分裂解，接着转移至2ml离心管中，将2ml离心管振荡2min，其后于15
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30℃孵育5min，加入200ul氯仿(按0.2ml氯仿/1ml Trizol)，盖紧管盖，充分振荡15
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60s，不大于12000g，2
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8℃离心15min，小心吸取上清转移至另一离心管中，切勿吸到中间层，加入500ul异丙醇(按0.5ml异丙醇/1ml Trizol)。
[0012]优选的，所述步骤S4中wb检测CIRBP、ACSL4、PTGS2、NOX1、GPX4、FTH1步骤为：a：收集蛋白样品，SDS
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PAGE凝胶配制，样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS
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PAGE蛋白上样缓冲液，上样与电泳，冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS
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PAGE胶加样孔内即可，100℃或沸水浴加热3
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5分钟，以充分变性蛋白；b：转膜(Transfer)，通常如果使用Bio
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Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300
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400mA，转膜时间为30
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60分钟。也可以在15
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20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短；c：封闭，转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1
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2分钟，以洗去膜上的转膜液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以4℃封闭过夜；d：一抗孵育，用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时，如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜，回收一抗，加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5
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10分钟，吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5
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10分钟，共洗涤3次，如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数；e：按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，二抗需根据一抗进行选择，用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时，回收二抗，加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5
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10分钟，吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5
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10分钟，共洗涤3次，如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数；f：蛋白检测(Detection of proteins)，使用BeyoEC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法，其特征在于：所述方法步骤包括如下：S1：材料准备，准备试剂细胞培养试剂：胎牛血清，DMEM
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高糖培养基，RPMI
‑
1640培养基，青链霉素，PBS磷酸钾缓冲液，Trypsin
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EDTA(0.25％)phenol red以及实验耗材6孔板细胞培养板，12孔板细胞培养板，24孔板细胞培养板，48孔板细胞培养板，96孔板细胞培养板，巴氏吸管；S2：细胞复苏，将水浴锅预热至37℃，用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面，在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等，取出冻存管，迅速解冻，迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，在冻存管内还存在一点点没融化的时候，取出，用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内，制备细胞悬液，将细胞转移至一个15ml离心管内，一滴一滴地加入预热好的培养基，同时一边晃动离心管；加入培养基的量要达到10ml以上，离心，在低速离心机上，以800rpm离心5分钟；吸去上清，然后用1ml培养基重悬细胞，将细胞悬液分装入培养皿内，将培养皿放入37℃含CO2的培养箱内培养，换液的时间由细胞沉降速度情况而定；S3：细胞培养，将水浴锅预热至37℃，用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面，在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等，取出细胞培养瓶，无菌操作，打开瓶盖，吸掉旧培养液，用PBS洗涤细胞一至二次，加入trypsin
‑
EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，轻洗细胞皿底部，吸掉trypsin
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EDTA溶液，放入37℃培养箱2
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3分钟，轻拍培养瓶壁使大部分细胞脱落，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用；S4：实验分组，检测项目为RIP检测CIRBP调控TP53、、PCR检测CIRBP、TP53、wb、CIRBP、ACSL4、PTGS2、NOX1、GPX4、FTH1、普鲁士蓝染色、激光共聚焦检测线粒体活性氧ROS、谷胱甘肽GSH检测、流式凋亡检测、细胞增殖生长曲线检测；S5：RIP检测P CIRBP调控TP53。2.根据权利要求1所述一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法，其特征在于：所述步骤S4中实验流程为：a：细胞裂解液获取；b：磁珠的准备；c：染色质剪切；d：RNA结合蛋白免疫沉淀；e：RNA纯化。3.根据权利要求1所述一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法，其特征在于：所述S4中RPCR检测CIRBP、TP53步骤为：样本总RNA提取、三步法荧光定量RT
‑
PCR反应、荧光定量PCR反应、荧光定量RT
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PCR数据分析。4.根据权利要求3所述一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法，其特征在于：样本总RNA提取步骤为取适当样本材料液氮研磨后加入1000ul Trizol充分裂解，接着转移至2ml离心管中，将2ml离心管振荡2min，其后于15
‑
30℃孵育5min，加入200ul氯仿(按0.2ml氯仿/1ml Trizol)，盖紧管盖，充分振荡15
‑
60s，不大于12000g，2
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8℃离心15min，小心吸取上清转移至另一离心管中，切勿吸到中间层，加入500ul异丙醇(按0.5ml异丙醇/
1ml Trizol)。5.根据权利要求1所述一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法，其特征在于：所述步骤S4中wb检测CIRBP、ACSL4、PTGS2、NOX1、GPX4、FTH1步骤为：a：收集蛋白样品，SDS
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PAGE凝胶配制，样品处理在...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈龙，高红强，廖承德，杨发科，谢燃，濮永祝，李进丹，冯成涛，王月，
申请(专利权)人：陈龙，
类型：发明
国别省市：