ROS响应性内皮细胞靶向丝素纳米微球、制备方法、应用技术

本发明专利技术公开了ROS响应性内皮细胞靶向丝素纳米微球、制备方法、应用，所述纳米微球以丝素蛋白为载体，载体内部形成载药空腔，载体表面结合有E

【技术实现步骤摘要】
ROS响应性内皮细胞靶向丝素纳米微球、制备方法、应用


[0001]本专利技术属于组织工程
，涉及一种靶向药物载体及其制备方法，具体为ROS响应性内皮细胞靶向丝素纳米微球、制备方法、应用。

技术介绍

[0002]生理状态下的血管内皮细胞(VECs)的增殖、迁移对于损伤组织重新构建血管网络及血管稳态的维持极为关键，如骨骼、肌肉损伤修复等；但异常的VECs活化、迁移、增殖所导致的血管重构、浸润常常引起某些疾病的发生及进展，如肿瘤细胞迁移、软骨退变、视网膜新生血管形成等。因此，针对性调节VECs在生理、病理条件下的增殖、迁移来治疗血管生成相关疾病潜力巨大。
[0003]现有技术中调节血管生成的药物制剂如VEGF
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α、TGF
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α、贝伐单抗等，大多存在价格昂贵、全身性副作用大等问题；目前有报道证明某些中药中含有的部分活性成分具有调节血管生成的能力，如川芎嗪、齐墩果酸等，其优点在于价格相对较低，但存在生物利用度低、无选择性等缺点，因此开发一种适用于负载中药活性组分的药物缓、控释载体是十分有必要的。
[0004]SF(丝素蛋白)作为一种具有良好生物相容性的天然可生物降解性材料，广泛应用于各类型的药物递送系统中，然而，其所制备出的缓释载体无特殊靶向性、亦无控释特性，这对于需要精确控制药物释放时间、剂量、区域的药物来讲是无法直接适用的。
[0005]研究显示，通过细胞表面受体介导的内吞作用能够促进细胞对纳米药物递送颗粒的摄取效率，同时受体的特异性对药物的靶向递送有重要意义；E
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选择素作为活化的VECs表面特异性受体，可与其配体E
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选择素结合肽(E
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selectin binding peptide,Esbp)相互作用，通过E
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选择素介导的细胞内吞作用，通过增加细胞内吞来造成纳米药物载体的局部富集，然而在实际操作过程中我们发现，单纯的E
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选择素修饰载体仅仅是赋予了SF载体靶向递药能力，并不具备药物控释的能力，短时间内药物在细胞内部的释放效率并无明显变化，导致其对于细胞的活力抑制作用并不明显，并不足以应对细胞内复杂的递药需求。
[0006]另有研究证实，在病理条件如缺氧、损伤、炎症等条件刺激下，VECs细胞内ROS(活性氧)水平均有着不同程度的上调，引起HIF
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1α(缺氧诱导因子)的稳定性增加，继而导致血管生成相关基因的转录，导致损伤部位微血管的浸润，这说明高ROS水平是病理性微血管浸润的必要条件之一，而这恰恰可作为控释制剂的响应性条件。缩硫酮类结构作为应用最为广泛的ROS响应修饰基团，经常活跃于各类肿瘤递药制剂中，我们希望将酮缩硫醇(TK)与Esbp
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SF载体结合在一起，赋予其ROS响应性，以应对复杂的体内递药需求，然而SF分子量较大，分子链结构较为复杂，常规的接枝方法很难将二者结合在一起。

技术实现思路

[0007]解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，本专利技术拟设计一种可以靶向血管内皮细胞的药物递送纳米微球，此载体以天然可生物降解性材料SF作为主要载体成分，Esbp
作为靶向性材料，TK作为胞内ROS响应控释基础，通过乳化法、Steglich法将缩硫酮醇、E
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选择素结合肽与SF微球结合，分别赋予其对特定细胞的靶向性及特殊条件的响应性，制备出了一种针对病理状态下的血管内皮细胞精准递药载药纳米微球，实现对药物的靶向控释。
[0008]基于此，本专利技术需实现以下目标：1、提供一种Esbp修饰的ROS响应TK/SF微球及其制备方法；2、将以上制备获得的微球用于负载药物，药物不限于脂溶性或水溶性。
[0009]技术方案：ROS响应性内皮细胞靶向丝素纳米微球，所述纳米微球以丝素蛋白为载体，载体内部形成载药空腔，载体表面结合有E
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选择素结合肽和酮缩硫醇。
[0010]以上所述的ROS响应性内皮细胞靶向丝素纳米微球的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0011]S1、向大豆油中加入Span80(司盘80，失水山梨糖醇脂肪酸酯)磁力搅拌混匀作为油相，将丝素蛋白和酮缩硫醇溶于超纯水作为水相，超声制成乳液；在磁力搅拌、加热条件下向乳液中逐滴加入无水乙醇，继续磁力搅拌后离心去上清得到丝素蛋白载体微球，采用无水乙醇重复洗涤丝素蛋白载体微球、过筛、离心、超纯水重复洗涤、冻干；
[0012]S2、将S1制得的丝素蛋白载体微球分散于氢氧化钠溶液中，磁力搅拌，水解其表面酯键，离心去上清，超纯水重复洗涤；
[0013]S3、将S2处理后的丝素蛋白载体微球置于含EDC和NHS的MES缓冲液中，磁力搅拌以活化其表面羧基，收集活化后的丝素蛋白载体微球；
[0014]S4、将S3收集的丝素蛋白载体微球转入稀醋酸
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Esbp溶液中，磁力搅拌、室温反应、离心，取反应后丝素蛋白载体微球置于稀甘氨酸溶液中以淬灭反应，离心去上清，采用无水乙醇、超纯水重复洗涤，以去除表面未结合或结合不牢固的ESBP及催化剂，冻干获得ROS响应性内皮细胞靶向丝素纳米微球。
[0015]优选的，S1中酮缩硫醇和丝素蛋白的质量比为1/10～1/1；水相与乳液的体积比为1/10～1/4；磁力搅拌速度为400rpm以下，加热温度为45
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50℃，搅拌时间为3h以下。进一步的，磁力搅拌速度为200rpm，搅拌时间为2h。
[0016]优选的，S2中氢氧化钠溶液的浓度为2g/L，丝素蛋白载体微球在氢氧化钠溶液中的浓度为20mg/mL以下，水解时间为2.5
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5min；超纯水洗涤时，丝素蛋白载体微球在超纯水中的浓度为50mg/mL以下。进一步的，丝素蛋白载体微球在氢氧化钠溶液中的浓度为5
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10mg/mL，水解时间为2.5min，丝素蛋白载体微球在超纯水中的浓度为30～40mg/mL。
[0017]优选的，S3中丝素蛋白载体微球在缓冲液中的浓度为20mg/mL以下，缓冲液中EDC、NHS、MES的浓度分别为50
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60mmol/L、25
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30mmol/L、50mmol/L，pH值为5
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6；磁力搅拌条件为4℃或冰水浴，活化时间为1h以下。进一步的，缓冲液中EDC、NHS、MES的浓度分别为50mmol/L、25mmol/L、50mmol/L，pH值为6，搅拌条件为冰水浴，反应时间为30min。
[0018]优选的，S4中丝素蛋白载体微球在稀醋酸
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Esbp溶液中的浓度为20mg/mL以下，稀醋酸
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Esbp溶液中Esbp的溶解浓度为0.5mg/mL，稀醋酸体积浓度为0.5％，反应时间为2h以内；甘氨酸溶液中甘氨酸的浓度小于1％，pH值在8以下；其中，稀醋酸
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Esbp溶液的溶剂为超纯水，甘氨酸溶液的溶剂为超纯水或PBS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.ROS响应性内皮细胞靶向丝素纳米微球，其特征在于，所述纳米微球以丝素蛋白为载体，载体内部形成载药空腔，载体表面结合有E
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选择素结合肽和酮缩硫醇。2.权利要求1所述的ROS响应性内皮细胞靶向丝素纳米微球的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1、向大豆油中加入Span80磁力搅拌混匀作为油相，将丝素蛋白和酮缩硫醇溶于超纯水作为水相，超声制成乳液；在磁力搅拌、加热条件下向乳液中逐滴加入无水乙醇，继续磁力搅拌后离心去上清得到丝素蛋白载体微球，采用无水乙醇重复洗涤丝素蛋白载体微球、过筛、离心、超纯水重复洗涤、冻干；S2、将S1制得的丝素蛋白载体微球分散于氢氧化钠溶液中，磁力搅拌，水解其表面酯键，离心去上清，超纯水重复洗涤；S3、将S2处理后的丝素蛋白载体微球置于含EDC和NHS的MES缓冲液中，磁力搅拌以活化其表面羧基，收集活化后的丝素蛋白载体微球；S4、将S3收集的丝素蛋白载体微球转入稀醋酸
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Esbp溶液中，磁力搅拌、室温反应、离心，取反应后丝素蛋白载体微球置于稀甘氨酸溶液中以淬灭反应，离心去上清，采用无水乙醇、超纯水重复洗涤，冻干获得ROS响应性内皮细胞靶向丝素纳米微球。3.根据权利要求2所述的ROS响应性内皮细胞靶向丝素纳米微球的制备方法，其特征在于，S1中酮缩硫醇和丝素蛋白的质量比为1/10～1/1；水相与乳液的体积比为1/10～1/4；磁力搅拌速度为400rpm以下，加热温度为45
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50℃，搅拌时间为3h以下。4.根据权利要求2所述的ROS响应性内皮细胞靶向丝素纳米微球的制备方法，其特征在于，S2中氢氧化钠溶液的浓度为2g/L，丝素蛋白载体微球在氢氧化钠溶液中的分散浓度为20mg/mL以下，水解时间为2.5
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5min；超纯水洗涤时，丝素蛋白载体微球在超纯水中的浓度为50mg/mL以下。5.根据权利要求2所述的ROS响应性内皮细胞靶向丝素纳米微球的制备方法，其特征在于，S3中丝素蛋白载体微球在缓冲液中的浓度为20mg/mL以下，缓冲液中EDC、NHS、MES的浓度分别为50
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60mmol/L、25
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30mmol/L、50mmol/L，pH值为5
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6；磁力搅拌条件为4℃或冰水浴，活化时间为1h以下。6.根据权利要求2所述的ROS响应性内皮细胞靶向丝素纳米微球的制备方法，其特征在于，S4中丝素蛋白载体微球在稀醋酸
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Esbp溶液中的浓度为20mg/mL以下，稀醋酸
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Esbp溶液中Esbp的溶解浓度为0.5mg/mL，稀醋酸的体积浓度为0.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭杨，涂鹏程，李彬，马勇，潘娅岚，刘孟敏，王礼宁，孙杰，孙孝先，赵梓彤，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：