基于固态纳米孔技术的抗衰寡肽的单分子检测方法技术

本发明专利技术属于分子检测技术领域，具体涉及一种基于固态纳米孔技术的抗衰寡肽的单分子检测方法。本发明专利技术方法如下：对氮化硅纳米孔芯片进行预处理以除去表面污染物；再通过介电击穿方法在芯片负载的氮化硅薄膜上制备纳米孔；然后将纳米孔芯片与定制的flowcell进行组装，并将溶有寡肽的缓冲液加入flowcell的顺式侧；通过施加偏电压驱动寡肽通过纳米孔，采集寡肽过孔时产生的电学信号进而实现抗皱寡肽的定性和/或定量分析。本发明专利技术方法能够高效地提供关于抗皱寡肽分子多重单分子构象及表面属性信息，为含抗皱寡肽产品的快速检测提供了新的方案，也对该类产品的研发以及市场监管具有重大意义。意义。意义。

【技术实现步骤摘要】
基于固态纳米孔技术的抗衰寡肽的单分子检测方法


[0001]本专利技术属于分子检测
，具体涉及一种基于固态纳米孔技术的抗衰寡肽的单分子检测方法。

技术介绍

[0002]近年来，具有生物活性的寡肽在抗衰化妆品的研发中广受关注，它们的功能包括信号传导、转运、酶和神经递质的抑制。以最受欢迎的六胜肽(Argireline)为例，其分子由六个特定的氨基酸(Glu
‑
Glu
‑
Met
‑
Gln
‑
Arg
‑
Arg)构成，被证明是能有效减少面部皱纹的药物之一；相关研究表明，六胜肽可以通过抑制神经肌肉连接处神经递质的释放，产生类似肉毒杆菌的作用，并且表现出高皮肤渗透性和低毒性，因此被用作肉毒杆菌治疗的替代品，在抗皱类化妆品中也得到广泛应用。此类寡肽的广泛应用也带来了检测的需求，在复杂环境下对抗皱寡肽精准定性和定量的技术不仅能推动抗皱寡肽的研究和应用，并且对于相关产品的鉴定和监管也有着重要意义。
[0003]目前对药物和化妆品中的肽的常用检测方法包括凯氏定氮法、荧光检测技术、化学发光检测法、电泳法、比色法、酶联免疫吸附剂测定法、质谱法、色谱法等，而对于此类寡肽最常用的方法为液相色谱法和质谱法。例如，公开号为CN115015369A的专利技术专利公开了一种小分子物质寡肽的检测方法，该专利通过将N
‑
苯基
‑1‑
(5
‑
甲基)萘胺溶于甲醇溶剂中得到浓度为10mg/mL的基质溶液，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪对小分子物质寡肽进行检测；公开号为CN105823848A的专利技术专利公开了一种水溶性寡肽的萃取方法及测定方法，该专利利用高效液相色谱法对水溶性寡肽进行检测。此类方法已被证明可以有效地定性和定量各类产品中的抗皱寡肽，但也存在着各种局限，如时间长、灵敏度低、需要标记等。更重要的是，这些方法多为体相检测，难以实现单分子尺度的检测，无法识别单个寡肽分子的物化信息。
[0004]纳米孔技术是一种新型的寡肽检测方法，具有免标记、速度快、高灵敏度、单分子检测等优势。在纳米孔检测平台中，生物纳米孔和固态纳米孔都被证明可以实现对短肽分子的检测。其中，生物纳米孔的孔径相对固定，对于种类不同的寡肽的检测有一定的局限性；而固态纳米孔具有孔径可调节、利于加工等特点，灵活的孔径使得固态纳米孔相较于生物纳米孔在寡肽的检测中更具有适用性。目前，至今未见报道有关基于固态纳米孔的抗衰寡肽的单分子检测方法，本专利对于寡肽分子的基础研究具有重要意义。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种基于固态纳米孔单分子技术检测寡肽的方法，本专利技术用硅基氮化硅薄膜作为纳米孔载体材料，对抗皱纹的寡肽分子进行电学信号检测。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]基于固态纳米孔单分子技术检测寡肽的方法，包括以下步骤：
[0008]S1：对氮化硅纳米孔芯片进行预处理并制备固态纳米孔；
[0009]S2：组装纳米孔检测平台并施加偏电压驱动寡肽通过所述固态纳米孔，通过采集寡肽过孔时产生的电学信号对寡肽进行定性和/或定量分析。
[0010]本专利技术利用纳米孔单分子检测技术对寡肽通过纳米孔时产生的电流阻滞信号进行采集，分析电流阻滞信号的幅值与停留时间，可以得到寡肽的所带电荷、体积、构象等物化信息，并可以通过改变固态纳米孔的孔径大小来适用于不同的寡肽分子检测，具有较高的适用性。相较于传统的寡肽检测方法，本专利技术采用的纳米孔技术具有免标记、速度快、高灵敏度、单分子检测等优势，是一种新型的寡肽检测方法。
[0011]进一步，所述寡肽包括三胜肽和/或六胜肽。
[0012]进一步，所述固态纳米孔的尺寸为1.8nm
‑
5nm。
[0013]进一步，采用1.8nm
‑
2.5nm的固态纳米孔检测三胜肽；采用2.5nm
‑
5nm的固态纳米孔检测六胜肽。
[0014]进一步，所述预处理为将氮化硅纳米孔芯片依次置于乙醇水溶液、丙酮、异丙醇中浸泡，烘干后清洗备用。
[0015]进一步，所述预处理具体包括以下步骤：
[0016]①
将氮化硅纳米孔芯片置于乙醇水溶液中浸泡20min，以去除表面的无机杂质；
[0017]②
分别在丙酮、异丙醇中浸泡20min，去除表面的有机杂质；
[0018]③
最后将芯片60℃烘干1min，再使用等离子体清洗仪清洗芯片正面5min，以去除掉残余的杂质并增加其表面亲水性，放入洁净容器中备用。
[0019]进一步，所述乙醇水溶液中，乙醇和水的体积比为1：1。
[0020]进一步，所述固态纳米孔的载体为氮化硅薄膜。
[0021]进一步，所述氮化硅薄膜的厚度为20nm。
[0022]进一步，通过介电击穿方法在所述氮化硅纳米芯片负载的氮化硅薄膜上制备所述固态纳米孔。
[0023]进一步，所述固态纳米孔的制备方法具体如下：
[0024]①
将预处理后的氮化硅纳米孔芯片安装在定制的flowcell中；
[0025]②
依次用乙醇、水、缓冲液(Buffer 1)浸润所述氮化硅纳米孔芯片；
[0026]③
在所述flowcell两侧注入所述缓冲液(Buffer 1)；
[0027]④
在所述flowcell两侧连接电极，再连接上电流源脉冲电介质击穿器；
[0028]⑤
通过电源表对芯片顺式侧施加逐步增大的间歇性脉冲电流，击穿薄膜形成纳米孔；
[0029]⑥
孔形成后，对芯片两侧继续施加间歇性电压，得到所需孔径的固态纳米孔。
[0030]进一步，具体的，步骤
②
中，依次用乙醇、水、缓冲液(Buffer 1)浸润芯片两边的表面，并去除其中的气泡。
[0031]步骤
⑤
中，SiNx薄膜暴露于强电场中，电荷聚集以及热效应会导致薄膜的缺陷被扩大，从而薄膜被击穿形成纳米孔。
[0032]进一步，制备纳米孔时所使用的缓冲液为1M KCl、10mM Tris、1mM EDTA，pH8。
[0033]进一步，S2具体为：将纳米孔芯片与定制的flowcell进行组装，并在所述flowcell的反式腔加入电解质溶液，顺式腔加入含有寡肽的电解质溶液；所述flowcell与膜片钳连
接，通过膜片钳在flowcell两端施加偏电压以实现寡肽的单分子检测。
[0034]进一步，通过Ag/AgCl电极将flowcell的两个腔室连接到膜片钳放大器的探头上，膜片钳与数模转换器连接并连接计算机；通过Clampfit程序对施加的偏电压进行控制并记录电流变化。
[0035]进一步，检测三胜肽时，所述flowcell的顺式腔和反式腔使用的电解质溶液均为Buff本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于固态纳米孔单分子技术检测寡肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：对氮化硅纳米孔芯片进行预处理并制备固态纳米孔；S2：组装纳米孔检测平台并施加偏电压驱动寡肽通过所述固态纳米孔，通过采集寡肽过孔时产生的电学信号对寡肽进行定性和/或定量分析。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述寡肽包括三胜肽和/或六胜肽。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固态纳米孔的尺寸为1.8nm
‑
5nm。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，采用1.8nm
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2.5nm的固态纳米孔检测三胜肽；采用2.5nm
‑
5nm的固态纳米孔检测六胜肽。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中，所述预处理为将氮化硅纳米孔芯片依次置于乙醇水溶液、丙酮、异丙醇中浸泡，烘干后清洗备用。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固态纳米孔的载体为氮化硅薄膜。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过介电击穿方法在所述氮...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁丽媛，秦富鹏，王德强，李荣洁，奇国栋，
申请(专利权)人：中国科学院重庆绿色智能技术研究院，
类型：发明
国别省市：