自动化核酸滚环扩增和酶标催化底物双重放大信号的DNA测序微流控生物芯片及方法技术

本发明专利技术公开了自动化核酸滚环扩增和酶标催化底物双重放大信号的DNA测序微流控生物芯片及方法，生物芯片基于核酸杂交技术、核酸滚环扩增、金纳米粒子放大、电化学活性酶标记、电化学酶催化底物生成电化学活性物质通过检测电化学信号强度进一步放大实现DNA测序；本发明专利技术通过以参比电极为基准向工作电极施加电压，电化学活性产物释放产生电子同时产生反应产物，通过测定电流值实现核酸测序。与传统的测序方法相比，灵敏度更高，检测结果快速，通过在传感电极上固定不同的测序探针可以实现高通量测序，对肿瘤的诊疗具有重要意义。对肿瘤的诊疗具有重要意义。对肿瘤的诊疗具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
自动化核酸滚环扩增和酶标催化底物双重放大信号的DNA测序微流控生物芯片及方法


[0001]本专利技术涉及生物测序领域，具体涉及自动化酶标催化底物放大信号的DNA测序微流控生物芯片，还涉及利用该生物芯片测序的方法。

技术介绍

[0002]基因突变与疾病及其相关，特别是恶性肿瘤常常伴随则基因突变，人恶性黑色素瘤、甲状腺癌、结直肠癌、肺癌等存在不同比例的B
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raf基因突变，胰腺癌存在不同比例的K
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ras 基因突变，PIK3CA基因突变作为肺癌、乳腺癌等肿瘤患者的早期筛查、诊断及预后判断中；并且基因突变类型也影响临床用药，因此对疾病相关基因的突变检测具有重要意义。
[0003]目前，用于基因突变常用的检测有焦磷酸测序法、单链构象异构多态分析技术、聚合酶链反应
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限制性片段长度多态性分析、探针扩增阻滞突变系统、高分辨率溶解曲线分析技术、高效液相色谱法、微数字聚合酶链反应。上述检测方法存在检测周期长、成本高、需要昂贵设备完成。
[0004]时检测技术(POCT)是现代医学检验领域极具潜力的新型检测技术。与传统临床检验相比，具有检测快速、操作简便、成本低、样品用量少等优点。随着各种生物传感技术如丝网印刷电极、免疫标记、酶联技术、生物芯片技术等在POCT中广泛应用，与传统的生化分析仪相比极大的缩短了分析时间并降低了检测成本，也为患者提供了自身随时监测的方便。因此，亟待开发基因突变的实时测序技术，为疾病的及时诊断和治疗提供便捷。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种自动化酶标催化底物放大信号的DNA测序微流控生物芯片；本专利技术的目的之二在于提供所述自动化酶标催化底物放大信号的DNA测序微流控生物芯片测序的方法。
[0006]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]1、自动化核酸滚环扩增和酶标催化底物双重放大信号的DNA测序微流控生物芯片，所述生物芯片基于核酸杂交技术、核酸滚环扩增、金纳米粒子放大、电化学活性酶标记、电化学酶催化底物生成电化学活性物质通过检测电化学信号强度进一步放大实现DNA测序；
[0008]所述生物芯片包括试剂供给单元、检测系统和废液收集装置，试剂供给单元与检测系统的入口连接，废液收集装置与检测系统的出口连接；所述检测系统主体为微流体通道，微流体通道上设置有捕获反应阵列位点；
[0009]所述试剂供给单元包括清洗溶液储存器、捕获探针1储存器、待测序列溶液储存器、滚环扩增引发链修饰的金纳米粒子
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探针复合物储存器、滚环扩增反应液储存器、电化学酶修饰的DNA链储存器和底物储存器；首先用电化学活性酶标记DNA探针2并与滚环扩增引发链修饰的金属纳米粒子复合形成滚环扩增引发链修饰的金纳米粒子
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探针2复合物；捕
获探针1 固定在微流控通道至少一个捕获反应阵列位点与一待测DNA序列片段的一端互补配对，待测序列的另一端与滚环扩增引发链修饰的金纳米粒子
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探针2复合物的探针2的DNA部分互补，清洗未配对的反应物，由微流控装置通入底物，在电化学酶的催化下转变为电化学活性物质并测量电信号，实现了滚环扩增及电化学信号的双重放大，实现DNA测序。
[0010]优选的，所述微流控通道由一个或多个进样通道组成，所述进样通道设置有至少一个分流道，反应阵列位点位于分流道上。
[0011]本专利技术优选的，所述废液储存器与检测系统的之间还连接有微流控清洗单元，微流控清洗单元一端与微流控通道出口连接，一端与废液储存器连接，还设置有与底物储存器连通的管道，用于底物回收并循环利用。
[0012]本专利技术优选的，所述生物芯片为地址化管理的微流控装置。
[0013]本专利技术优选的，所述清洗溶液为但不限于PBS液；所述电化学活性酶为但不限于碱性磷酸酶；所述底物为但不限于含氨基苯基磷酸酯的PBS溶液。
[0014]本专利技术优选的，所述传感电极的材料为但不限于金属、金属氧化物、金属碳化物、导电塑料、导电聚合物、碳材料或其组合物或混合物。
[0015]本专利技术优选的，所述捕获探针为但不限于检测癌症、慢性病或病原微生物相关基因的核酸序列。
[0016]本专利技术优选的，所述清洗单元收集的回收至底物储存器的反应液可用电化学逆向反应回收后继续使用。
[0017]本专利技术优选的，所述微流控通道由印刷、3
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D打印、微加工、电沉积或真空沉积制备。
[0018]本专利技术优选的，所述试剂供给单元通过处理器产生PWM信号控制注射泵，实现样品量的动态调节。
[0019]本专利技术优选的，所述检测系统采用ARM架构的STM32微处理器作为核心芯片搭建电路。
[0020]2、利用所述自动化酶标催化底物放大信号的DNA测序微流控生物芯片测序的方法，包括如下步骤：
[0021]1)在传感电极上修饰待测序列的核酸探针，所述核酸探针特异识别所述待测序列测序区域；
[0022]2)将待测序列样品通入检测系统，使待测序列的一端与修饰于传感电极表面的核酸探针杂交，然后通入清洗液清洗，然后再通入滚环扩增引发片段修饰的金纳米粒子/探针复合物，探针部分与待测序列的另一端杂交，使滚环扩增引发片段修饰的金纳米粒子/探针复合物固定于传感电极表面，然后通入PBS清洗未结合滚环扩增引发片段修饰的金纳米粒子/探针复合物；
[0023]3)通入滚环扩增反应液，利用其中的DNA聚合酶进行扩增，再通入PBS清洗，然后通入底物并在电化学酶催化下转化为电化学活性物质，由此可调高底物浓度和/或延长反应时间，实现电化学信号双重放大特效，并通过电化学方法检测，根据核酸探针序列确定待测序列。
[0024]本专利技术优选的，所述滚环扩增反应液为但不限于含Phi29DNA聚合酶，dNTPs混合液和 BSA的溶液。
[0025]本专利技术优选的，所述核酸探针根据待测序列测序区域设计或待测序列不同突变类型设计。
[0026]本专利技术的有益效果在于：本专利技术公开了自动化核酸滚环扩增和酶标催化底物双重放大信号的DNA测序微流控生物芯片，该装置利用核酸探针识别待测序列，然后通过核酸滚环扩增和金纳米粒子双重放大体系实现信号双重放大，然后利用电化学酶催化底物使无电化学活性的电化学酶变为电化学活性产物，通过以参比电极为基准向工作电极施加电压，电化学活性产物释放产生电子同时产生反应产物，通过测定电流值实现核酸测序。基于这样原理，一种采用电化学酶催化标记放大杂化核酸信号的方法可作为恶性肿瘤的，检测结果作为肿瘤诊断或个性化用药提供指导，与传统的测序方法相比，灵敏度更高，检测结果快速，通过在传感电极上固定不同的测序探针可以实现高通量测序，对肿瘤的诊疗具有重要意义。
附图说明
[0027]为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：
[0028]图1为聚吡咯丙酸(PPA)的制备原理图；
[0029]图2为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.自动化核酸滚环扩增和酶标催化底物双重放大信号的DNA测序微流控生物芯片，其特征在于：所述生物芯片基于核酸杂交技术、核酸滚环扩增、金纳米粒子放大、电化学活性酶标记、电化学酶催化底物生成电化学活性物质通过检测电化学信号强度进一步放大实现DNA测序；所述生物芯片包括试剂供给单元、检测系统和废液收集装置，试剂供给单元与检测系统的入口连接，废液收集装置与检测系统的出口连接；所述检测系统主体为微流体通道，微流体通道上设置有捕获反应阵列位点；所述试剂供给单元包括清洗溶液储存器、捕获探针1储存器、待测序列溶液储存器、滚环扩增引发链修饰的金纳米粒子
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探针复合物储存器、滚环扩增反应液储存器、电化学酶修饰的DNA链储存器和底物储存器；首先用电化学活性酶标记DNA探针2并与滚环扩增引发链修饰的金属纳米粒子复合形成滚环扩增引发链修饰的金纳米粒子
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探针2复合物；捕获探针1固定在微流控通道至少一个捕获反应阵列位点与一待测DNA序列片段的一端互补配对，待测序列的另一端与滚环扩增引发链修饰的金纳米粒子
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探针2复合物的探针2的DNA部分互补，清洗未配对的反应物，由微流控装置通入底物，在电化学酶的催化下转变为电化学活性物质并测量电信号，实现了滚环扩增及电化学信号的双重放大，实现DNA测序。2.根据权利要求1所述自动化酶标催化底物放大信号的DNA测序微流控生物芯片，其特征在于：所述微流控通道由一个或多个进样通道组成，所述进样通道设置有至少一个分流道，反应阵列位点位于分流道上。3.根据权利要求1所述自动化酶标催化底物放大信号的DNA测序微流控生物芯片，其特征在于：所述废液储存器与检测系统的之间还连接有微流控清洗单元，微流控清洗单元一端与微流控通道出口连接，一端与废液储存器连接，还设置有与底物储存器连通的管道，用于底物回收并循环利用。4.根据权利要求1所述自动化酶标催化底物放大信号的DNA测序微流控生物芯片，其特征在于：所述生物芯片为地址化管理的微流控装置。5.根据权利要求1所述自动化酶标催化底物放大信号的DNA测序微流控生物芯片，其特征在于：所述清洗溶液为但不限于PBS液；所述电化学活性酶为但不限于碱性磷酸酶；所述底物为但不限于含氨基苯基磷酸酯的PBS溶液。6.根据权利要求1所述自动化酶标催化底物放大信号的DNA测序微流控生物芯片，其特征在于：所述传感电极的材料为但不限于金属、...

【专利技术属性】
技术研发人员：李长明，史转转，谷雨，刘峰，
申请(专利权)人：苏州科技大学，
类型：发明
国别省市：