一种分子模拟双酚A特异性多肽的筛选方法技术

本发明专利技术提出一种分子模拟双酚A特异性多肽的筛选方法，属于食品安全技术领域。所述方法包括如下步骤：1)通过蛋白叠加和分子对接，全面解析蛋白质结构数据库中双酚A

【技术实现步骤摘要】
一种分子模拟双酚A特异性多肽的筛选方法


[0001]本专利技术属于食品安全
，尤其是涉及一种分子模拟双酚A特异性多肽的筛选方法。

技术介绍

[0002]双酚A(BPA)属于“环境激素”，其结构与内源性雌激素结构相似，有类似雌性激素的作用，是一种内分泌干扰素。双酚A在工业生产中广泛用于聚碳酸酯塑料、环氧树脂和热敏纸的生产。由于大规模生产和广泛应用，其在环境中普遍存在。双酚A可以通过不同的方式进入人体，如消化道、呼吸道和皮肤。研究表明，双酚A能干扰内分泌系统，降低免疫功能，损害生殖能力，导致新生儿早熟，增加前列腺癌、乳腺癌、子宫癌的发病率，还与肥胖，糖尿病，心脏病，哮喘等疾病相关联。
[0003]我国GB 9685
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2016《食品安全国家标准食品接触材料及制品用添加剂使用标准》规定了食品接触材料及制品用添加剂相关要求，双酚A的迁移量为0.6mg/kg，并明确规定双酚A不能用于制造婴幼儿专用食品接触材料及制品。2018年，欧盟委员会发布法规(EU)2018/213修订双酚A在食品接触材料中的迁移量及合规声明等要求，食品接触青漆和凃料中双酚A的迁移量为0.05mg/kg，且使用清漆和涂层材料的婴幼儿配方食品、较大婴儿配方食品、婴儿谷类食品、婴儿食品、为满足幼儿营养需求的特殊医疗用途食品、幼儿乳基饮料或类似产品均不得检出双酚A。因此，建立一种快速、灵敏、准确的检测方法非常重要。
[0004]目前，常用的免疫分析技术中，关键步骤之一是高特异性抗体的制备。然而，抗体的制备步骤复杂，动物免疫存在一定失败率，这种“试错法”周期长、费时费力，成为快速检测技术的瓶颈。
[0005]随着生物信息学成果的累积，采用分子模拟进行各组分虚拟结合、筛选、相互作用模拟展示等方面的研究不断增加。运用计算机模拟技术来模拟受、配体之间的分子对接，虚拟氨基酸突变来解释蛋白质CDR区氨基酸残基之间的相互作用，经虚拟氨基酸突变后的结构其生物学特性发生了改变，可以提高整体的亲和力及稳定性，同时分子动力学可以模拟真实实验环境，进一步优化构象。因此，建立一种采用分子模拟技术进行双酚A特异性多肽的筛选方法很有必要。
[0006]近年来具有抗体特异性识别元件(适配体、小分子抗体、分子印迹聚合物等)是研究热点。多肽是介于氨基酸和蛋白质之间的一类物质，具有分子量小、活性高、特异性强、无免疫原性以及易合成等优点，同时具有结构多样性、特异性和对目标分析物的结合亲和力，因此，可作为特异性识别元件应用在实际检测方法建立中。

技术实现思路

[0007]本专利技术提出一种分子模拟双酚A特异性多肽的筛选方法以及利用双酚A特异性多肽进行双酚检测的方法，以解决上述技术问题。
[0008]本专利技术提出一种分子模拟双酚A特异性多肽的筛选方法，包括如下步骤：
[0009]1)通过蛋白叠加和分子对接，全面解析蛋白质结构数据库中双酚A
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蛋白共晶化合物的分子结构和相互作用获取受体蛋白及原始母链；
[0010]2)根据步骤1)所得原始母链，分析分子对接结果中主要作用氨基酸进行亲本肽段的截取得亲本多肽；
[0011]3)通过对步骤2)所得亲本多肽进行虚拟氨基酸突变，构建与双酚A特异性结合的多肽库，运用分子动力学对多肽进行初步筛选；
[0012]4)将步骤3)筛选得到的多肽链作为特异性识别元件，用异硫氰酸荧光素标记多肽组成特异性识别探针，将特异性识别探针与双酚A混合，根据荧光差值不同筛选出与双酚A特异性结合能力最强的多肽序列。
[0013]进一步地，所述步骤1)具体为：
[0014]在蛋白质结构数据库中搜索双酚A
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蛋白共晶化合物，将所有检索到的蛋白结构导入分子模拟平台，运行分子对接并分析分子对接结果，以对接结果中作用打分值最高的蛋白作为原始蛋白；在蛋白质结构数据库中搜索双酚A
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蛋白共晶化合物，将所有检索到的蛋白结构导入分子模拟平台，运行蛋白叠加并分析蛋白叠加结果，分析双酚A
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蛋白复合物的分子结构和作用位点，选择主要作用氨基酸最集中的蛋白作为母链。
[0015]进一步地，所述步骤2)具体为：
[0016]根据上述原始母链，分析分子对接结果中的受配体主要作用氨基酸和2D作用图，根据尽量多的包含主要作用氨基酸的原则进行肽链截取；对所有截取的肽链与配体进行分子对接，选出对接打分函数值较高的肽链。
[0017]进一步地，步骤2)中，肽链截取的受配体结合的范围为温度为298.15K。
[0018]进一步地，所述步骤3)中，通过对上述亲本多肽进行虚拟氨基酸突变，构建与双酚A特异性结合的多肽库具体为：
[0019]将上述对接打分函数值较高的肽链进行虚拟氨基酸突变，先采用基于稳定性的虚拟氨基酸定点突变来确定关键氨基酸，然后对关键氨基酸进行饱和突变，确定最佳突变类型；
[0020]对所有饱和突变结果进行随机排列组合，得所有组合结果序列；
[0021]将所有组合结果序列组成多肽库，将多肽库中所有组合结果序列与双酚A进行分子对接；分析所有对接结果函数打分值，然后从结果序列能量打分值中选取较高的6条多肽链。
[0022]进一步地，所述步骤3)中，所述的运用分子动力学对多肽进行初步筛选具体为：
[0023]对多肽库中的6条多肽链进行分子动力学模拟，模拟常温溶液状态下多肽与双酚A的特异性识别能力；
[0024]选择分子动力学模拟后的最后一帧的多肽构象与双酚A进行分子对接，分析对接结果，选出2条打分值最高的多肽链。
[0025]本专利技术还提出上述任一所述的双酚A特异性多肽进行双酚检测的方法，包括如下步骤：
[0026](1)特异性荧光探针合成：将筛选所得双酚A特异性多肽与异硫氰酸荧光素通过碳酰胺化反应偶联，异硫氰酸荧光素标记多肽合成特异性识别双酚A的特异性荧光探针；
[0027](2)探针与双酚A特异性识别：向步骤(1)所得特异性荧光探针的溶液中滴加双酚A
溶液震荡孵育，使探针与目标物特异性识别；
[0028](3)荧光猝灭：在步骤(2)探针与目标物孵育结束后，向体系中添加氧化石墨烯分散液，基于荧光共振能量转移原理，猝灭未结合目标物的探针荧光；
[0029](4)检测荧光强度值：经步骤(3)处理后，双酚A与特异性荧光探针结合，经氧化石墨烯猝灭后测定溶液荧光强度，根据荧光差值分析与双酚A浓度之间的关系。
[0030]本专利技术具有以下优势：
[0031]本专利技术提出的双酚A特异性多肽的优化筛选方法，利用Discovery Studio分子模拟平台，分析蛋白作用位点，构建特异性多肽库，用异硫氰酸荧光素(FITC)标记多肽组成特异性识别探针，优化筛选特异性多肽，为特异性识别原件的制备提供了新思路新方法。该方法避免了抗体复杂的制备步骤、适配体繁琐的筛选过程，可以大大缩短实验时间，节约实验成本，同时避免了人为误差以及环境等不可控因素的干扰，实现了特异性识本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分子模拟双酚A特异性多肽的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：1)通过蛋白叠加和分子对接，全面解析蛋白质结构数据库中双酚A
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蛋白共晶化合物的分子结构和相互作用获取受体蛋白及原始母链；2)根据步骤1)所得原始母链，分析分子对接结果中主要作用氨基酸进行亲本肽段的截取得亲本多肽；3)通过对步骤2)所得亲本多肽进行虚拟氨基酸突变，构建与双酚A特异性结合的多肽库，运用分子动力学对多肽进行初步筛选；4)将步骤3)筛选得到的多肽链作为特异性识别元件，用异硫氰酸荧光素标记多肽组成特异性识别探针，将特异性识别探针与双酚A混合，根据荧光差值不同筛选出与双酚A特异性结合能力最强的多肽序列。2.根据权利要求1所述的分子模拟双酚A特异性多肽的筛选方法，其特征在于：所述步骤1)具体为：在蛋白质结构数据库中搜索双酚A
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蛋白共晶化合物，将所有检索到的蛋白结构导入分子模拟平台，运行分子对接并分析分子对接结果，以对接结果中作用打分值最高的蛋白作为原始蛋白；在蛋白质结构数据库中搜索双酚A
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蛋白共晶化合物，将所有检索到的蛋白结构导入分子模拟平台，运行蛋白叠加并分析蛋白叠加结果，分析双酚A
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蛋白复合物的分子结构和作用位点，选择主要作用氨基酸最集中的蛋白作为母链。3.根据权利要求1所述的分子模拟双酚A特异性多肽的筛选方法，其特征在于：所述步骤2)具体为：根据上述原始母链，分析分子对接结果中的受配体主要作用氨基酸和2D作用图，根据尽量多的包含主要作用氨基酸的原则进行肽链截取；对所有截取的肽链与配体进行分子对接，选出对接打分函数值较高的肽链。4.根据权利要求3所述的分子模拟双酚A特异性多肽的筛选方法，其特征在于：步骤2)中，肽链截取的受配体结合的范围为...

【专利技术属性】
技术研发人员：李安军，赵雷兴，姜利，郭新光，岳涛，刘冰，汤有宏，仇凯，刘国英，孟镇，明深圳，高红波，郑淼，王晓龙，
申请(专利权)人：天津科技大学中国食品发酵工业研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：