一种草地贪夜蛾中甲维盐抗性基因的鉴定方法、dsRNA及其应用技术

本发明专利技术提供了一种草地贪夜蛾中甲维盐抗性基因的鉴定方法、dsRNA及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术结合基因组重测序和转录组测序鉴定出了草地贪夜蛾中针对甲维盐的关键抗性基因，并基于关键抗性基因GSTD6和CTP6A18的mRNA保守序列，设计了dsRNA，并通过RNAi技术可以有效降低草地贪夜蛾对甲维盐的抗药性，对发展有效的草地贪夜蛾抗性治理策略以延缓抗性的产生、鉴定害虫防治的新靶标具有重要实践意义。重要实践意义。重要实践意义。

【技术实现步骤摘要】
一种草地贪夜蛾中甲维盐抗性基因的鉴定方法、dsRNA及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及一种草地贪夜蛾中甲维盐抗性基因的鉴定方法、dsRNA及其应用。

技术介绍

[0002]草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)是联合国粮农组织全球预警的重大跨境迁飞性害虫，幼虫可为害玉米、小麦、水稻等350多种植物。草地贪夜蛾于2019年1月自中缅边境侵入我国云南省普洱市江城县并大面积爆发危害，对云南省乃至全国的玉米等粮食作物生产造成巨大威胁。目前国内外关于草地贪夜蛾的防治手段仍以化学防治为主，其特点是见效快、成本低等。甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(简称为甲维盐)是一种半合成的高效、低毒生物源杀虫剂，已被用于蔬菜、果树及棉花等作物害虫的防治。研究表明，甲维盐对草地贪夜蛾具有较强的毒力效果，校正死亡率超过90％，田间防效试验发现甲维盐对草地贪夜蛾具有良好的速效性和持效性，优于其他药剂，可作为防控草地贪夜蛾的首选药剂之一。
[0003]然而，草地贪夜蛾不仅已经对众多传统化学农药产生抗性，通过对广东省佛山、茂名、韶关市草地贪夜蛾田间种群的抗药性进行调查，发现草地贪夜蛾田间种群对新型生物源杀虫剂甲维盐均已产生不同程度的抗药性。目前关于甲维盐对草地贪夜蛾作用的研究主要集中在毒力效应和抗性遗传方面，而对于抗性机制的研究还鲜有报道。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术目的在于提供一种草地贪夜蛾中甲维盐抗性基因的鉴定、dsRNA及其应用，本专利技术结合基因组重测序和转录组测序鉴定出草地贪夜蛾中针对甲维盐的关键抗性基因，并通过对关键抗性基因进行RNA干扰调节草地贪夜蛾对甲维盐的抗性，本专利技术提供的调节草地贪夜蛾甲维盐抗性的dsRNA可有效调节草地贪夜蛾对甲维盐的抗性，对发展有效的草地贪夜蛾抗性治理策略以延缓抗性的产生、鉴定害虫防治的新靶标具有重要实践意义。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]一种草地贪夜蛾中甲维盐抗性基因的鉴定方法，包括以下步骤：
[0007]S1、甲维盐抗药性种群和敏感种群的基因组重测序分析；
[0008]S2、抗药性种群和敏感种群的转录组测序分析；
[0009]S3、抗药性相关候选基因的鉴定：将S1中得到的抗性相关基因组区域与S2得到的差异表达基因进行交联，找到两者交叉的候选抗性相关基因；
[0010]S4、荧光定量PCR验证候选抗性相关基因在甲维盐抗性品系和敏感品系草地贪夜蛾中的表达量差异。
[0011]一种所述鉴定方法鉴定所得的调节草地贪夜蛾甲维盐抗性的dsRNA，所述dsRNA为dsRNA
‑
1或dsRNA
‑
2；其中，所述dsRNA
‑
1由如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列转录而成；所述
dsRNA
‑
2由如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列转录而成。
[0012]本专利技术还提供一种合成上述方案所述dsRNA
‑
1或dsRNA
‑
2的模板DNA，所述dsRNA
‑
1的模板mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述dsRNA
‑
2的模板mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0013]本专利技术还提供一种上述方案所述的dsRNA或所述模板mRNA在调节草地贪夜蛾甲维盐抗性中的应用。
[0014]本专利技术还提供一种上述方案所述的dsRNA或所述模板mRNA在制备调节草地贪夜蛾甲维盐抗性产品中的应用。
[0015]本专利技术还提供一种上述方案所述的dsRNA或所述模板mRNA在防治草地贪夜蛾中的应用。
[0016]本专利技术还提供一种上述方案所述的dsRNA或所述模板mRNA在制备防治草地贪夜蛾产品中的应用。
[0017]本专利技术还提供一种调节草地贪夜蛾甲维盐抗性的方法，所述方法为：将上述方案中所述的dsRNA导入草地贪夜蛾体内。
[0018]有益技术效果：本专利技术提供了一种草地贪夜蛾中甲维盐抗性基因的鉴定方法、dsRNA及其应用，本专利技术结合基因组重测序和转录组测序鉴定出了草地贪夜蛾中针对甲维盐的关键抗性基因，并基于关键抗性基因GSTD6和CYP6A18的mRNA保守序列，设计了dsDNA，通过RNAi技术可以有效降低草地贪夜蛾对甲维盐的抗药性，对发展有效的草地贪夜蛾抗性治理策略以延缓抗性的产生、鉴定害虫防治的新靶标具有重要实践意义。
附图说明
[0019]图1为全基因组区域FST值分布曼哈顿图；
[0020]图2为全基因组选择性清扫分析结果；
[0021]图3为差异表达基因火山图；
[0022]图4为6个基因的表达情况；其中，图4A为；图4B为6个基因受甲维盐不同致死浓度处理后在草地贪夜蛾体内的表达量变化；
[0023]图5为GSTD6和CYP6A18的表达情况；其中，图5A与5B分别表示GSTD6和CYP6A18在不同组织中的表达量差异；5C与5D表示dsGSTS6和dsCYP6A18的RNAi干扰效率；5E表示受到RNAi处理后草地贪夜蛾受甲维盐胁迫的死亡率；不同的字母表示通过使用Tukey honestly significant difference multiple range检验的显著性差异(P<0.05)；星号表示通过使用Student
’
s t检验的显著差异(*P<0.05，**P<0.01)。
具体实施方式
[0024]本专利技术提供了一种草地贪夜蛾中甲维盐抗性基因的鉴定方法，包括以下步骤：
[0025]S1、甲维盐抗药性种群和敏感种群的基因组重测序分析；
[0026]S2、抗药性种群和敏感种群的转录组测序分析；
[0027]S3、抗药性相关候选基因的鉴定：将S1中得到的抗性相关基因组区域与S2得到的差异表达基因进行交联，找到两者交叉的候选抗性相关基因；
[0028]S4、荧光定量PCR验证候选抗性相关基因在甲维盐抗性品系和敏感品系草地贪夜
蛾中的表达量差异。
[0029]本专利技术对甲维盐抗药性种群和敏感种群的基因组重测序分析。
[0030]在本专利技术中，所述甲维盐抗药性种群和敏感种群为从云南省元江县(东经101
°
58
′
，北纬23
°
35
′
，海拔421m)玉米上采集的草地贪夜蛾在实验室保存后进行连续的甲维盐抗性选育，抗药性种群为对甲维盐有27.1倍抗性水平的种群，敏感种群为不经任何杀虫剂胁迫的种群，表现出对甲维盐的敏感。
[0031]在本专利技术中，所述基因组重测序分析包括：通过比对定位重测序获得的测序reads在参考基因组上的位置，统计各样品的测序深度、基因组覆盖度等信息，并进行SNPs和InDel(插入缺失)变异的检测；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种草地贪夜蛾中甲维盐抗性基因的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、甲维盐抗药性种群和敏感种群的基因组重测序分析；S2、抗药性种群和敏感种群的转录组测序分析；S3、抗药性相关候选基因的鉴定：将S1中得到的抗性相关基因组区域与S2得到的差异表达基因进行交联，找到两者交叉的候选抗性相关基因；S4、荧光定量PCR验证候选抗性相关基因在甲维盐抗性品系和敏感品系草地贪夜蛾中的表达量差异。2.一种权利要求1所述鉴定方法鉴定所得的调节草地贪夜蛾甲维盐抗性的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA为dsRNA
‑
1或dsRNA
‑
2；其中，所述dsRNA
‑
1由如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列转录而成；所述dsRNA
‑
2由如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列转录而成。3.一种合成权利要求2所述dsRNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙仲享，鲁智慧，桂富荣，陈亚平，付鹏飞，李冬桂，李浩，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：