用于抑制MARC1表达的RNAi构建体和方法技术

本发明专利技术涉及用于降低MARC1基因表达的RNAi构建体。还描述了使用此类RNAi构建体治疗或预防肝纤维化和脂肪肝病诸如非酒精性脂肪肝病和非酒精性脂肪性肝炎的方法。和非酒精性脂肪性肝炎的方法。和非酒精性脂肪性肝炎的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于抑制MARC1表达的RNAi构建体和方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年8月13日提交的美国临时申请号63/065,190和于2021年6月23日提交的美国临时申请号63/214,016的权益，两者的内容通过引用以其全文并入本文。
[0003]电子提交的文本文件的说明
[0004]本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且将其通过引用以其全文并入本文。2021年8月3日创建的序列表的计算机可读格式副本命名为A
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2664
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WO
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PCT_ST25，并且大小为1,064千字节。


[0005]本专利技术涉及用于调节线粒体偕胺肟还原组分1(mARC1)蛋白质的肝脏表达的组合物及方法。特别地，本专利技术涉及通过RNA干扰降低MARC1基因表达的基于核酸的治疗剂、及利用这类基于核酸的治疗剂来降低循环脂质水平以及治疗或预防脂肪肝病和肝纤维化的方法。

技术介绍

[0006]非酒精性脂肪肝病(NAFLD)构成一系列肝脏病变，为世界上最常见的慢性肝病，其患病率在过去20年中翻倍，且如今据估计影响了约20％
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30％世界人口。在一些个体中，肝脏中异位脂肪的积累(称为脂肪变性)触发炎症和肝细胞损伤，导致更晚期疾病，称为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。NASH被定义为脂质积累，具有细胞损伤、炎症和不同程度的瘢痕或纤维化的迹象。截至2015年，预计7500万至1亿名美国人患有NAFLD，而NASH占NAFLD诊断的大约10％
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30％。
[0007]mARC1蛋白质是线粒体外膜中的含钼蛋白，对N
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氧合分子的还原进行催化(Klein等人,J Biol Chem[生物化学杂志],第287卷(51):42795
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42803,2012；Ott等人,J Biol Inorg Chem[生物无机化学杂志],第20卷(2):265
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275,2015)。它是最突出的生物转化酶之一(CYP450)的高效对应物，并且参与偕胺肟前药的活化以及含有N
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羟基化官能团的其他药物的灭活(Neve等人,PLoS One[公共科学图书馆
·
综合],第10卷(9):e0138487,2015；Ott等人,2015,同上)。最近，据报道，MARC1基因的预测功能丧失变体与降低的血液胆固醇和肝酶水平、降低的肝脏脂肪和肝硬化保护相关。参见Emdin等人,bioRxiv 594523；//doi.org/10.1101/594523,2019；以及Emdin等人,PLoS Genet[PLoS遗传学],第16卷(4):e1008629,2020。具体而言，对8个队列中12,361例全因肝硬化病例和790,095例对照进行分析，mARC1编码区的A165T错义变体与全因肝硬化的保护、计算机断层成像的肝脂肪水平较低、医生诊断的脂肪肝的几率较低以及丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、总胆固醇和LDL胆固醇的低血液水平相关(Emdin等人,2020,同上)。另外还鉴定出了与较低的胆固醇水平、肝酶水平和降低的肝硬化风险相关的MARC1等位基因(M187K错义突变和R200Ter截短突变)(Emdin等人，2020年，同上)。这些数据表明，mARC1酶的缺乏保护免于慢性肝病和肝硬化。因此，靶向mARC1功能的治疗剂代表了降低胆固醇水平(例如非HDL胆固醇或LDL
‑
胆固醇水平)和肝纤维化，以
及治疗或预防肝病(特别是NAFLD和NASH)的新方法。

技术实现思路

[0008]本专利技术部分基于靶向MARC1基因且降低其在肝细胞中的表达的RNAi构建体的设计和产生。MARC1基因表达的序列特异性抑制可用于治疗或预防与血脂水平升高和肝脂肪相关的病症，诸如心血管疾病和脂肪肝病。因此，在一个实施例中，本专利技术提供一种包含有义链和反义链的RNAi构建体，其中该反义链包含具有与mARC1 mRNA序列基本上互补的序列的区域。例如，在一些实施例中，反义链包含与人mARC1 mRNA序列(SEQ ID NO:1)的区域的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补(有不超过1、2或3个错配)的序列。在某些实施例中，反义链包含具有来自表1或表2中列出的反义序列的至少15个连续核苷酸的区域。
[0009]在一些实施例中，本文所述的RNAi构建体的有义链包含与反义链的序列充分互补以形成长度为约15至约30个碱基对的双链体区的序列。在这些和其他实施例中，有义链和反义链的长度各自独立地为约19至约30个核苷酸。在一些实施例中，RNAi构建体包含一个或两个平端。在其他实施例中，RNAi构建体包含一个或两个核苷酸突出端。此类核苷酸突出端可包含1至6个未配对核苷酸，且可位于有义链3'端、反义链3'端、或有义链和反义链两者的3'端。在某些实施例中，RNAi构建体在有义链3'端和反义链3'端包含具有两个未配对核苷酸的突出端。在其他实施例中，RNAi构建体在反义链3'端包含具有两个未配对核苷酸的突出端，且在有义链3'端/反义链5'端包含平端。
[0010]本专利技术的RNAi构建体可包含一种或多种经修饰的核苷酸，包括对核糖环、核碱基或磷酸二酯主链具有经修饰的核苷酸。在一些实施例中，RNAi构建体包含一种或多种2'
‑
修饰的核苷酸。此类2'
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修饰的核苷酸可包括2'
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氟修饰的核苷酸、2'
‑
O
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甲基修饰的核苷酸、2'
‑
O
‑
甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'
‑
O
‑
烷基修饰的核苷酸、2'
‑
O
‑
烯丙基修饰的核苷酸、二环核酸(BNA)、脱氧核糖核苷酸、或其组合。在一个特定实施例中，RNAi构建体包含一个或多个2'
‑
氟修饰的核苷酸、2'
‑
O
‑
甲基修饰的核苷酸、或其组合。在一些实施例中，RNAi构建体的有义链和反义链中的所有核苷酸均为经修饰的核苷酸。无碱基核苷酸可掺入本专利技术的RNAi构建体中，例如，作为有义链的3'端、5'端、或3'端和5'端的末端核苷酸。在此类实施例中，无碱基核苷酸可以是反向的，例如通过3'
‑
3'核苷酸间键或5'
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5'核苷酸间键附接至相邻核苷酸。
[0011]在一些实施例中，RNAi构建体包含至少一个主链修饰，例如经修饰的核苷酸间或核苷间键。在某些实施例中，本文所述的RNAi构建体包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。在特定实施例中，硫代磷酸酯核苷酸间键可位于有义链和/或反义链的3'或5'端。例如，在一些实施例中，反义链在3'端和5'端两者的末端核苷酸之间包含两个连续的硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些此类实施例中，有义链在其3'端的末端核苷酸之间包含一个或两个硫代本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含有义链和反义链的RNAi构建体，其中该反义链包含具有与mARC1 mRNA序列基本上互补的序列的区域，且其中所述区域包含来自表1或表2中列出的反义序列的至少15个连续核苷酸。2.如权利要求1所述的RNAi构建体，其中该有义链包含与该反义链的序列充分地互补以形成长度为约15至约30个碱基对的双链体区的序列。3.如权利要求2所述的RNAi构建体，其中该双链体区的长度为约17至约24个碱基对。4.如权利要求2所述的RNAi构建体，其中该双链体区的长度为约19至约21个碱基对。5.如权利要求1至4中任一项所述的RNAi构建体，其中该有义链和该反义链的长度各自独立地为约19至约30个核苷酸。6.如权利要求5所述的RNAi构建体，其中该有义链和该反义链的长度各自独立地为约19至约23个核苷酸。7.如权利要求1至6中任一项所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体包含一个或两个平端。8.如权利要求1至6中任一项所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体包含具有1至4个未配对核苷酸的一个或两个核苷酸突出端。9.如权利要求8所述的RNAi构建体，其中该核苷酸突出端具有2个未配对的核苷酸。10.如权利要求8或9所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体在该有义链的3
′
端、该反义链的3
′
端、或者该有义链和该反义链两者的3
′
端包含核苷酸突出端。11.如权利要求1至10中任一项所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体包含至少一个经修饰的核苷酸。12.如权利要求11所述的RNAi构建体，其中该经修饰的核苷酸是2
′‑
修饰的核苷酸。13.如权利要求11所述的RNAi构建体，其中该经修饰的核苷酸是2
′‑
氟修饰的核苷酸、2
′‑
O
‑
甲基修饰的核苷酸、2
′‑
O
‑
甲氧基乙基修饰的核苷酸、2
′‑
O
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烷基修饰的核苷酸、2
′‑
O
‑
烯丙基修饰的核苷酸、二环核酸(BNA)、脱氧核糖核苷酸、或其组合。14.如权利要求11所述的RNAi构建体，其中该有义链和该反义链中的所有核苷酸均为经修饰的核苷酸。15.如权利要求14所述的RNAi构建体，其中该经修饰的核苷酸是2
′‑
O
‑
甲基修饰的核苷酸、2
′‑
氟修饰的核苷酸、或其组合。16.如权利要求1至15中任一项所述的RNAi构建体，其中该有义链在其3
′
端、其5
′
端、或其3
′
和5
′
端两者处包含作为末端核苷酸的无碱基核苷酸。17.如权利要求16所述的RNAi构建体，其中该无碱基核苷酸通过3
′‑3′
核苷酸间键或5
′‑5′
核苷酸间键附接至相邻核苷酸。18.如权利要求1至17中任一项所述的RNAi构建体，其中该有义链、该反义链或该有义链和反义链两者包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。19.如权利要求18所述的RNAi构建体，其中该反义链在3'端和5'端两者的末端核苷酸之间包含两个连续的硫代磷酸酯核苷酸间键。20.如权利要求18或19所述的RNAi构建体，其中该有义链在3
′
端的末端核苷酸之间包含单个硫代磷酸酯核苷酸间键。21.如权利要求18或19所述的RNAi构建体，其中该有义链在3
′
端的末端核苷酸之间包
含两个连续的硫代磷酸酯核苷酸间键。22.如权利要求1至21中任一项所述的RNAi构建体，其中该反义链包含选自表1或表2中列出的反义序列的序列或由其组成。23.如权利要求1至22中任一项所述的RNAi构建体，其中该反义链包含选自以下的序列或由其组成：SEQ ID NO:715；SEQ ID NO:732；SEQ ID NO:733；SEQ ID NO:738；SEQ ID NO:754；SEQ ID NO:761；SEQ ID NO:763；SEQ ID NO:764；SEQ ID NO:766；SEQ ID NO:809；SEQ ID NO:810；SEQ ID NO:814；SEQ ID NO:841；SEQ ID NO:848；SEQ ID NO:851；SEQ ID NO:862；SEQ ID NO:916；SEQ ID NO:1057；SEQ ID NO:1078；SEQ ID NO:2919；SEQ ID NO:2926；SEQ ID NO:2946；SEQ ID NO:2949；SEQ ID NO:2953；和SEQ ID NO:2956。24.如权利要求1至23中任一项所述的RNAi构建体，其中该有义链包含选自表1或表2中列出的有义序列的序列或由其组成。25.如权利要求24所述的RNAi构建体，其中该有义链包含选自以下的序列或由其组成：SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:63；SEQ ID NO:64；SEQ ID NO:69；SEQ ID NO:85；SEQ ID NO:92；SEQ ID NO:94；SEQ ID NO:95；SEQ ID NO:97；SEQ ID NO:140；SEQ ID NO:141；SEQ ID NO:145；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:179；SEQ ID NO:182；SEQ ID NO:193；SEQ ID NO:247；SEQ ID NO:388；SEQ ID NO:390；SEQ ID NO:391；SEQ ID NO:409；SEQ ID NO:2808；和SEQ ID NO:2820。26.如权利要求1至25中任一项所述的RNAi构建体，其中：(i)该有义链包含SEQ ID NO:46的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:715的序列或由其组成；(ii)该有义链包含SEQ ID NO:63的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:732的序列或由其组成；(iii)该有义链包含SEQ ID NO:64的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:733的序列或由其组成；(iv)该有义链包含SEQ ID NO:69的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:738的序列或由其组成；(v)该有义链包含SEQ ID NO:85的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:754的序列或由其组成；(vi)该有义链包含SEQ ID NO:92的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:761的序列或由其组成；(vii)该有义链包含SEQ ID NO:94的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:763的序列或由其组成；(viii)该有义链包含SEQ ID NO:95的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:764的序列或由其组成；(ix)该有义链包含SEQ ID NO:97的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:766的序列或由其组成；(x)该有义链包含SEQ ID NO:140的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:809的序列或由其组成；(xi)该有义链包含SEQ ID NO:141的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:810
的序列或由其组成；(xii)该有义链包含SEQ ID NO:145的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:814的序列或由其组成；(xiii)该有义链包含SEQ ID NO:172的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:841的序列或由其组成；(xiv)该有义链包含SEQ ID NO:179的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:848的序列或由其组成；(xv)该有义链包含SEQ ID NO:182的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:851的序列或由其组成；(xvi)该有义链包含SEQ ID NO:193的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:862的序列或由其组成；或(xvii)该有义链包含SEQ ID NO:247的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:916的序列或由其组成。27.如权利要求1至25中任一项所述的RNAi构建体，其中：(i)该有义链包含SEQ ID NO:409的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:1078的序列或由其组成；(ii)该有义链包含SEQ ID NO:388的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:1057的序列或由其组成；(iii)该有义链包含SEQ ID NO:2808的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:2926的序列或由其组成；(iv)该有义链包含SEQ ID NO:2820的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:2946的序列或由其组成；(v)该有义链包含SEQ ID NO:391的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:2949的序列或由其组成；(vi)该有义链包含SEQ ID NO:390的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:2956的序列或由其组成；(vii)该有义链包含SEQ ID NO:179的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:2919的序列或由其组成；(viii)该有义链包含SEQ ID NO:388的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:2953的序列或由其组成；或(ix)该有义链包含SEQ ID NO:388的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:1057的序列或由其组成。28.如权利要求27所述的RNAi构建体，其中：(i)该有义链包含根据SEQ ID NO:3078的经修饰的核苷酸的序列或由其组成，且该反义链包含根据SEQ ID NO:3337的经修饰的核苷酸的序列或由其组成；(ii)该有义链包含根据SEQ ID NO:3080的经修饰的核苷酸的序列或由其组成，且该反义链包含根据SEQ ID NO:3339的经修饰的核苷酸的序列或由其组成；(iii)该有义链包含根据SEQ ID NO:3163的经修饰的核苷酸的序列或由其组成，且该反义链包含根据SEQ ID NO:3441的经修饰的核苷酸的序列或由其组成；
(iv)该有义链包含根据SEQ ID NO:3183的经修饰的核苷酸的序列或由其组成，且该反义链包含根据SEQ ID NO:3469的经修饰的核苷酸的序列或由其组成；(v)该有义链包含根据SEQ ID NO:3076的经修饰的核苷酸的序列或由其组成，且该反义链包含根据SEQ ID NO:3472的经修饰的核苷酸的序列或由其组成；(vi)该有义链包含根据SEQ ID NO:3077的经修饰的核苷酸的序列或由其组成，且该反义链包含根据SEQ ID NO:3484的经修饰的核苷酸的序列或由其组成；(vii)该有义链包含根据SEQ ID NO:2051的经修饰的核苷酸的序列或由其组成，且该反义链包含根据SEQ ID NO:3545的经修饰的核苷酸的序列或由其组成；(viii)该有义链包含根据SEQ ID NO:3080的经修饰的核苷酸的序列或由其组成，且该反义链包含根据SEQ ID NO:3481的经修饰的核苷酸的序列或由其组成；(ix)该有义链包含根据SEQ ID NO:3188的经修饰的核苷酸的序列或由其组成，且该反义链包含根据SEQ ID NO:3339的经修饰的核苷酸的序列或由其组成；(x)该有义链包含根据SEQ ID NO:3080的经修饰的核苷酸的序列或由其组成，且该反义链包含根据SEQ ID NO:3476的经修饰的核苷酸的序列或由其组成；或(xi)该有义链包含根据SEQ ID NO:3223的经修饰的核苷酸的序列或由其组成，且该反义链包含根据SEQ ID NO:3517的经修饰的核苷酸的序列或由其组成。29.如权利要求1至28中任一项所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体是表1
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24中列出的双链体化合物中的任一种。30.如权利要求29所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体是D
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2078、D
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2079、D
‑
2081、D
‑
2182、D
‑
2196、D
‑
2238、D
‑
2241、D
‑
2243、D
‑
2246、D
‑
2255、D
‑
2258、D
‑
2301、D
‑
2316、D
‑
2317、D
‑
2329、D
‑
2332、D
‑
2341、D
‑
2344、D
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2356、D
‑
2357、D
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2399或D
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2510。31.如权利要求30所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体是D
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2079、D
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2081、D
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2317、D
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2357或D
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2399。32.一种用于抑制细胞中人MARC1基因的表达的RNAi构建体，所述RNAi构建体包含杂交以形成长度为约15至约30个碱基对的双链体区的有义链和反义链，且其中该反义链包含具有与SEQ ID NO:1的核苷酸1205至1250中的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补的序列的区域。33.如权利要求32所述的RNAi构建体，其中该反义链的该区域包含与SEQ ID NO:1的核苷酸1209至1239中的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补的序列。34.如权利要求32或33所述的RNAi构建体，其中该反义链的该区域包含CAUCUAAUAUUCCAG序列(SEQ ID NO:3656)。35.如权利要求32所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体是D
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2063、D
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2066、D
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2076、D
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2436、D<...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：美国安进公司，
类型：发明
国别省市：