小鼠抗人IV型胶原α5链NC1段单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术属于抗体领域，具体提供一种小鼠抗人IV型胶原α5链NC1段单克隆抗体及其应用，所述小鼠抗人IV型胶原α5链NC1段单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C2022240的杂交瘤细胞株NC1#4分泌产生。本发明专利技术在国内首先开发、成功制备了小鼠抗人IV型胶原α5链NC1段单克隆抗体，该单抗是IV型胶原α5链免疫荧光或组化检测得以开展的关键，而这对AS诊断具重要意义，并有助于遗传方式的确定。预初临床验证实验显示，本发明专利技术制备的单抗与市面抗体的免疫荧光检测结果完全一致，而且更易于结果解读。而且更易于结果解读。而且更易于结果解读。

【技术实现步骤摘要】
小鼠抗人IV型胶原
α
5链NC1段单克隆抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及抗体领域，具体涉及小鼠抗人IV型胶原α5链NC1段单克隆抗体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]IV型胶原(type IV collagen)是构成基底膜的重要框架蛋白，α链是构成IV型胶原分子的亚单位，一个IV型胶原分子由3条α链组成。迄今为止，人类IV型胶原α链发现6种，分别称为α1～α6链，其编码基因分别为COL4A1
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6。根据氨基酸序列和功能不同α5链可分为三个结构域：1.氨基端7S区；2.胶原区，包含“Gly
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X
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Y”重复序列；3.羧基端非胶原区(NC1)。NC1区控制了IV型胶原单体的缔结，在不同种族之间其氨基酸序列是高度保守的，但不同α链NC1区氨基酸序列明显不同，这是制备单克隆抗体的分子基础。
[0003]Alport综合征(Alport syndrome，AS)，又称遗传性肾炎、眼
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耳
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肾综合征，是一最为常见的遗传性肾小球疾病，临床主要表现为血尿、蛋白尿、进行性肾功能衰竭伴感音神经性耳聋、眼部病变。1988年Atkin首先将AS相关基因定位于X染色体，1990年Barker等成功克隆到COL4A5基因即编码Ⅳ型胶原α5链的基因，并在X伴性遗传AS(XLAS)患者中发现了第一个COL4A5基因突变，随后越来越多的COL4A5基因突变被发现，而COL4A3和COL4A4基因与常染色体遗传AS相关。
[0004]采用针对IV型胶原α5链NC1段的单克隆抗体行免疫荧光检测，对XLAS和常染色体隐性遗传AS(ARAS)具重要诊断价值。正常情况下，α5(Ⅳ)链存在于肾小球基底膜、远端肾小管基底膜和包氏囊壁内，免疫荧光呈阳性、连续线样，而在XLAS男性患者，α5链免疫荧光绝大多数呈阴性，XLAS女性患者免疫荧光则多呈不连续阳性。此外，IV型胶原α5链亦见于皮肤的表皮基底膜，同肾脏，正常情况下，α5链免疫荧光亦呈阳性、连续线样，而XLAS男性免疫荧光绝大多数为阴性，XLAS女性免疫荧光多为不连续阳性，因此对于部分发现疾病时肾功能已出现严重损害而丧失肾穿刺机会的患者，皮肤活检行IV型胶原α5链检测可替代肾组织起到疾病诊断的作用。对于部分ARAS患者，研究者发现抗α5链单抗在远端肾小管基底膜和包氏囊呈连续沉积，但在肾小球基底膜上无沉积，这一特异免疫荧光检测结果仅见于ARAS。因此α5链免疫荧光检测不仅对XLAS具重要诊断价值，对部分ARAS患者亦具诊断价值，更有助于AS遗传方式的确定。
[0005]专利文献CN110531088A公开了一种IV型胶原蛋白检测试剂盒，包含混有包被鼠抗人IV型胶原蛋白单克隆抗体胶乳颗粒的试剂；专利文献CN102010470B公开了一种抗IV型胶原单克隆抗体。而目前未见如本文所述小鼠抗人IV型胶原α5链NC1段单克隆抗体。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合人IV型胶原α5链NC1段，由保藏号为CCTCC NO:C2022240的杂交瘤细胞株NC1#4分泌产生。
[0007]本专利还提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体包含：H链可变区和L链可变区，
其中(a)所述H链可变区包括三个互补决定区，为SEQ ID NO:17表示的CDR1序列、由SEQ ID NO:19表示的CDR2序列和由SEQ ID NO:21表示的CDR3序列，以及(b)所述L链可变区包括三个互补决定区，为SEQ ID NO:37表示的CDR1序列、由SEQ ID NO:39表示的CDR2序列和由SEQ ID NO:41表示的CDR3序列。
[0008]优选地，所述单克隆抗体识别包含由SEQ ID NO:1表示的第251
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475位氨基酸序列的表位。
[0009]优选地，所述单克隆抗体是人源化的。
[0010]本专利还提供了单克隆抗体在制备检测人IV型胶原的试剂盒中的应用。
[0011]优选地，所述试剂盒用于人IV型胶原α5链的免疫荧光检测。
[0012]优选地，所述试剂盒用于诊断Alport综合征。
[0013]本专利还提供了一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株保藏编号为CCTCC NO:C2022240。
[0014]本专利技术的有益效果在于：在国内首先开发、成功制备了小鼠抗人IV型胶原α5链NC1段单克隆抗体，该单抗是IV型胶原α5链免疫荧光或组化检测得以开展的关键，而这对AS诊断具重要意义，并有助于遗传方式的确定。目前国际仅日本具有这一单抗产品，价格昂贵。预初临床验证实验显示，我们制备的单抗与日本公司的抗体免疫荧光检测结果完全一致，且更易解读结果。
附图说明
[0015]图1：CO4A5
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Ecoli的SDS
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PAGE和Western Blot分析。
[0016]图2：肾组织细胞上清克隆免疫荧光检测。上清4,11,19免疫荧光阳性，阳性部位上清4和19同对照抗体，但19上清荧光强度明显弱；11#上清荧光明显阳性部位与对照抗体类似，但除远端肾小管基底膜外其他肾小管基底膜亦有非特异弱阳性。A：Cosmobio抗体；B：上清2；C：上清3；D：上清4；E：上清5；F:上清6；G：上清8；H：上清9；I：上清10；J：上清11；K：上清12；L：上清13；M：上清14；N：上清15；O：上清17；P：上清18；Q：上清19；R：上清21。(400x)
[0017]图3：皮肤组织细胞上清克隆免疫荧光检测。a：Cosmobio抗体(200x)；b：4#上清(200x)；c：11L#上清(200x)；d：19#上清(200x)。
[0018]图4：肾组织抗α5(IV)单克隆抗体免疫荧光检测。A,B：Cosmobio抗体(A:100x；B:400x)；C,D：4#单抗(C:100x；D:400x)；E,F：5#单抗(E:100x；F:400)；G,H：11#单抗(G:100x；H:400x)。
[0019]图5：皮肤组织抗α5(IV)单克隆抗体免疫荧光检测。a：Cosmobio抗体(200x)；b：4#单抗(200x)；c：5#单抗(200x)；d：11#单抗(200x)。
[0020]图6：4#单抗肾组织免疫荧光检测。A,B：Cosmobio抗体在对照非Alport综合征患者肾组织免疫荧光检测结果(A:100x；B:400x)；C,D：4#单抗在对照非Alport综合征患者肾组织免疫荧光检测结果(C:100x；D:400x)；E,F：Cosmobio抗体在X伴性遗传Alport综合征女性患者肾组织免疫荧光检测结果示阳性不连续(E；100x；F:400x)；G,H：4#单抗在X伴性遗传Alport综合征女性患者肾组织免疫荧光检测结果示阳性不连续(G:100x；H:400x)。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性结合人IV型胶原α5链NC1段，由保藏号为CCTCC NO:C2022240的杂交瘤细胞株NC1#4分泌产生。2.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包含：H链可变区和L链可变区，其中(a)所述H链可变区包括三个互补决定区，为SEQ ID NO:17表示的CDR1序列、由SEQ ID NO:19表示的CDR2序列和由SEQ ID NO:21表示的CDR3序列，以及(b)所述L链可变区包括三个互补决定区，为SEQ IDNO:37表示的CDR1序列、由SEQ ID NO:39表示的CDR2序列和由SEQ ID NO:41表示的CDR3序列。...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘晓霞，谢静远，徐静，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属瑞金医院，
类型：发明
国别省市：