本发明专利技术涉及一种用液相色谱法分离测定羧甲基壳聚糖中杂质一缩二乙二醇酸（钠）（ＤＧＡ）的方法。本发明专利技术所说的一种用液相色谱方法分离测定羧甲基壳聚糖类产品中杂质ＤＧＡ的高效液相色谱方法，是以Ｃ１８为填料的色谱柱，以缓冲盐（ｐＨ值１．５～３．５）与有机相按一定配比组成的混合溶液为流动相，以紫外检测器进行检测定量。该方法能够有效地分离测定羧甲基壳聚糖中的杂质ＤＧＡ，本发明专利技术解决了羧甲基壳聚糖中的杂质ＤＧＡ的分离测定问题，从而保证了羧甲基壳聚糖的质量可控。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用液相色谱法分离测定羧甲基壳聚糖中杂质的方法。
技术介绍
甲壳素是自然界存储量仅次于纤维素的第二大天然多糖类化合物，其化学结构为e- (i一4) -2-N-乙酰氨基-2-脱氧D--葡萄糖，其脱乙酰基的产物为壳聚糖，由于甲壳素和壳聚糖 均不能直接溶于水，极大地限制了其应用。壳聚糖在碱性条件下与氯乙酸反应可得羧甲基化 壳聚糖，与壳聚糖相比，羧甲基壳聚糖具有更好的水溶性，因此在医药、生物医学工程等领域 有着广泛的应用。外科手术后的愈合过程中，由于切口周围纤维组织的增生和渗透，不可避 免会发生粘连，会导致肠梗阻、运动障碍、疼痛等后遗症。羧甲基壳聚糖可用来防止术后粘 连的发生。由于部分羧甲基壳聚糖类手术防粘连产品在临床应用时少数患者会出现结膜充血 的不良反应，研究发现在羧甲基壳聚糖类物质中含有从未见报道的一种杂质，对该杂质采用 电喷雾质谱、红外光谱及色谱等方法进行了结构鉴定，证实该杂质为一缩二乙二醇酸(钠) (DGA)。采用兔离体主动脉进行的血管舒张活性研究结果表明，DGA对氯化钾和去甲肾上腺 素预收缩主动脉环均有舒张作用，且呈浓度依赖性，因此导致羧甲基壳聚糖类手术防粘连类 产品临床上出现结膜充血的不良反应的主要原因是由于产品中含有杂质DGA。由于在羧甲基壳聚糖类物质研究中从未见有关杂质DGA的报道，因此，建立了该杂质的 高效液相色谱(HPLC)检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种测定羧甲基壳聚糖类产品中杂质DGA的高效液相色谱方法，' 从而实现对羧甲基壳聚糖类产品屮杂质DGA的定量测定。本专利技术所说的一种用液相色谱方法分离测定羧甲基壳聚糖类产品中杂质DGA的高效液相 色谱方法，采用反相色谱法，以缓冲盐(pH值1.5 3.5)与有机相按一定配比组成的混合溶 液为流动相。上述所说的反相色谱法选用C18为填料的色谱柱。 本专利技术的流动相中有机相选自下列化合物甲醇和乙腈。本专利技术的缓冲盐溶液主要指磷酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液，优选磷酸盐缓冲液，优选磷 酸二氢钾缓冲溶液。本专利技术的缓冲盐溶液的浓度为0.0()5~0.1 mol ■ L—'，优选0.01 mol L—'。本专利技术的缓冲盐溶液的pH值为1.5 3 .5,优选为2.0。 本专利技术的缓冲盐溶液-有机相的体积比为85: 15~98: 2，优选97: 3。 本专利技术所述的分离测定方法，可按以下方法实现1) 取羧甲基壳聚糖样品适量，加入体积比为7:3的甲醇水溶液，超声提取IO分钟，6000 r/min离心10分钟，用流动相稀释制备成待测样品溶液。2) 设置流动相的流速为0.2 1.0 ml/mm，优选0.5ml/min;检测波长204~220跳优选 210nm;色谱柱柱温为25 50°C，优选30。C。3) 取])的样品2(V1注入高效液相色谱仪，实现DGA的分离测定。 其中高效液相色谱仪WATERS高效液相色谱仪 色谱柱Symmetry300 Cl8 (4.6 x150mm)流动相(0.01mmol/L磷酸二氢钾缓冲溶液，以磷酸调pH2.0)-甲醇=97: 3 流速0.5ml/min 检测波长210mn 进样体积2(^1本专利技术采用C18色谱柱，能够有效地分离测定羧甲基壳聚糖中的杂质DGA;线性试验表明，在一定浓度范围内，DGA的回归方程的相关系数r-0.9998;本专利技术解决了羧甲基壳聚糖中的杂质DGA的分离测定问题，从而保证了羧甲基壳聚糖的 质量可控。 附图说明附图l为(0.01Ommol/L磷酸二氢钾缓冲溶液，以磷酸调pH2.0)-甲醇=97: 3条件下， 羧甲基壳聚糖中DGA的色谱图，图1中保留时间为3.771min的色谱峰为DGA。附图2为(0.005mmol/L磷酸二氢钾缓冲溶液，以磷酸调pH2.0)-甲醇=97: 3条件下， 羧甲基壳聚糖中DGA的色谱图，图2巾保留时间为4.002min的色谱峰为DGA。具体实施例方式实施例1仪器与条件WATERS高效液相色谱仪；色谱柱Symmetry300 C18(4.6 x 150mm);流动相(0.01mmol/L4磷酸二氢钾缓冲溶液，以磷酸调pH2.0)-甲醇=97: 3;流速0.5ml/min;检测波长210nm: 进样体积2(Vl实施歩骤取羧甲基壳聚糖样品适量，加入体积比为7:3的甲醇水溶液，超声提取10分钟，6000r/min离心IO分钟，用流动相稀释制备成待测样品溶液。取待测样品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图l。 附图1中保留时间为3.771min的色谱峰为DGA，附图1说明在此条件下羧甲基壳聚糖中DGA杂质能够很好地分离测定。实施例2 仪器与条件WATERS高效液相色谱仪；色谱柱Symmetry300 C18 (4.6 x 150mm);流动相 (0.005mmol/L磷酸二氢钾缓冲溶液，以磷酸调pH2.0)-甲醇,7: 3;流速0.5ml/min;检 测波长210nm;进样体积20pl实施步骤取羧甲基壳聚糖样品适量，加入体积比为7:3的甲醇水溶液，超声提取10分钟，6000 r/min离心IO分钟，用流动相稀释制备成待测样品溶液。取待测样品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图2。 附图1中保留时间为4.002rnin的色谱峰为DGA，附图2说明在此条件下羧甲基壳聚糖中DGA杂质能够很好地分离测定。权利要求1. 一种用液相色谱法分离测定羧甲基壳聚糖中杂质一缩二乙二醇酸(钠)(DGA)的方法，其特征在于以C18柱为分离柱，以缓冲盐溶液与有机相按一定配比组成的混合溶液为流动相。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的有机相选自甲醇和乙腈。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的缓冲盐溶液选自磷酸盐缓冲液和醋酸盐缓 冲液，优选磷酸盐缓冲液，优选磷酸——二氢钾缓冲溶液。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的缓冲盐溶液的浓度为0.005 0.1 mol ■ L—1， 优选0.01 mol L-1。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在丁-所述的缓冲盐溶液的pH值为1.5 ~3 .5，优选为 2.0。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的缓冲盐溶液与甲醇的体积比为85:15 98: 2,优选97: 3。7. 根据权利要求l所述的方法，其特征在于所述的方法包含以下歩骤1) 取羧甲基壳聚糖样品适量，加入体积比为7:3的甲醇水溶液，超声提取10分钟，6000 r/min离心10分钟，用流动相稀释制备成待测样品溶液。2) 设置流动相的流速为0.2~1.0 ml/min,优选0.5ml/min;检测波长204 220nm,优选210nm; 色谱柱柱温为25~50°C ，优选30°C 。3) 取l)的样品2(^1注入高效液相色谱仪，记录色谱图。 '全文摘要本专利技术涉及一种用液相色谱法分离测定羧甲基壳聚糖中杂质一缩二乙二醇酸(钠)(DGA)的方法。本专利技术所说的一种用液相色谱方法分离测定羧甲基壳聚糖类产品中杂质DGA的高效液相色谱方法，是以C18为填料的色谱柱，以缓冲盐(pH值1.5～3.5)与有机相按一定配比组成的混合溶液为流动相，以紫外检测器进行检测定量。该方法能够有效地分离测定羧甲基壳聚糖中的杂质DG本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用液相色谱法分离测定羧甲基壳聚糖中杂质一缩二乙二醇酸（钠）（ＤＧＡ）的方法，其特征在于：以Ｃ１８柱为分离柱，以缓冲盐溶液与有机相按一定配比组成的混合溶液为流动相。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吕志华，王远红，姜廷福，管华诗，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]
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