一种鉴定杂交独蒜兰幼苗一致性的引物及其鉴定方法技术

本发明专利技术涉及一种鉴定杂交独蒜兰幼苗一致性的引物及其鉴定方法，属于生物技术领域。本发明专利技术利用ISSR技术对杂交独蒜兰幼苗进行总DNA提取、ISSR

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定杂交独蒜兰幼苗一致性的引物及其鉴定方法


[0001]本专利技术属于生物
，特别涉及一种鉴定杂交独蒜兰幼苗一致性的引物及其鉴定方法。

技术介绍

[0002]独蒜兰属隶属于兰科(Orchidaceae)树兰亚科(Epidendroideae)，其原生种本身花型雅致、花色艳丽、花朵硕大，适于作为小型盆栽花卉，具有极高的观赏价值。该属的种间亲和性较高，目前已培育出越来越多环境适应性强、具有更高观赏价值的杂交种。
[0003]无菌播种已成为实现种苗扩繁的有效途径，但该途径繁育的植株由于性状分离，容易导致后代个体间性状不一致，尤其表现在一些多代杂交后的品种上。与种子无菌萌发获得的幼苗(种子苗)相比，无性克隆的后代(无性克隆苗)植株能够更好地保持母本的优良性状，得到的幼苗遗传背景更为均一。因此，若在早期能对种子苗和无性克隆苗进行鉴定和区分，进而才能保证独蒜兰商品成花一致性和整齐性。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种鉴定杂交独蒜兰幼苗一致性的引物及其鉴定方法，可以在幼苗早期利用ISSR分子标记进行一致性鉴定。相比传统以表型性状为基础鉴定杂交独蒜兰一致性，本专利技术提供的引物及鉴定方法更为高效，且能在幼苗早期即进行鉴定。
[0005]为实现上述目的，本专利技术是通过如下技术方案实现的：
[0006]本专利技术提供了一种用于鉴定杂交独蒜兰幼苗一致性的ISSR
‑
PCR引物，该引物的碱基序列表示如下：
[0007]引物UBC825：5r/>′‑
ACACACACACACACACT
‑3′
，碱基数17。
[0008]本专利技术提供了一种用于鉴定杂交独蒜兰幼苗一致性的试剂盒，包括上述引物UBC825。
[0009]进一步优选，试剂盒反应体系总体积为50μL，含有2
×
TakaraTaq(5U/μL)0.25μL、10
×
PCRBuffer(Mg
2+
plus)5μL、dNTPMixture(各2.5mM)4μL、模板DNA(80ng/μL)1μL、Primer1.5μL、其余为ddH2O。
[0010]本专利技术还提供了一种杂交独蒜兰幼苗一致性的鉴定方法，包括如下步骤：
[0011](1)提取待测样品DNA；
[0012](2)ISSR
‑
PCR扩增及电泳检测：采用上述试剂盒对待测样品的DNA进行ISSR
‑
PCR扩增和电泳检测；
[0013](3)观察与鉴定：根据扩增产物的条带数，判定待测杂交独蒜兰个体之间的一致性。
[0014]进一步优选，步骤(1)中，选取样本的方式可根据鉴定目的分为两种：1)鉴定后代各个体之间的一致性：在同一批幼苗中选取样本；2)鉴定母本与后代各个体之间的一致性：所选取样本包含外植体母本以及来自其母本的子代。待测幼苗样本可为无性克隆苗样本或
种子苗样本。
[0015]进一步优选，步骤(1)中，随机挑选待测样品，样本数不少于6个。
[0016]进一步优选，步骤(1)中，待测样品DNA的提取方法：剪取杂交独蒜兰幼苗的新鲜叶片100mg，然后采用植物基因组试剂盒提取总DNA，并用超微量紫外分光光度计，对样品DNA浓度、OD值进行检测，DNA浓度在80ng/μL左右、OD
260/280
在1.8左右视为达标，指标合格后再用1％凝胶电泳检测DNA质量，条带清晰、无弥散现象的DNA样视为合格，最后放入
‑
20℃冰箱中进行保存。
[0017]进一步优选，所述鉴定方法的ISSR
‑
PCR反应扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸2min，3步PCR循环扩增，循环次数为34次；72℃延伸7min。
[0018]本专利技术的有益效果：
[0019]与现有技术相比，本专利技术能够更加简便、高效地对杂交独蒜兰幼苗进行一致性鉴定。与传统以表型性状为基础鉴定方法相比，本专利技术能够在幼苗早期进行一致性鉴定，大幅度减少工作量、降低成本，保证同一批幼苗性状一致，有利于独蒜兰属花卉产业的发展。
[0020]目前在独蒜兰属ISSR分子标记领域，没有利用ISSR对杂交品种的幼苗进行一致鉴定，更没有将无菌播种的个体和无性克隆单株进行比较，以此来建立杂交品种组培苗的质量评价体系。与现有相关研究相比，本专利技术具有创新性，能够在幼苗早期完成一致性鉴定。
附图说明
[0021]图1是P.limprichtii
×
P.Snow Monkey和P.Snow Monkey
×
P.Confirmation的无性克隆苗与种子苗DNA电泳检测图；其中M：Mark；Mark左侧为P.limprichtii
×
P.Snow Monkey的DNA样本，1
‑
3是无性克隆苗DNA，4
‑
6是种子苗DNA；Mark右侧为P.Snow Monkey
×
P.Confirmation的DNA样本，1
‑
3是无性克隆苗DNA，4
‑
6是种子苗DNA。
[0022]图2是复筛引物筛选部分结果；其中，M：Marker，1
‑
17：UBC825，UBC826，UBC827，UBC828，UBC829，UBC830，UBC831，UBC832，UBC833，UBC834，UBC835，UBC836，UBC837，UBC838，UBC839，UBC840，UBC841。
[0023]图3是引物UBC825分别对P.limprichtii
×
P.Snow Monkey和P.Snow Monkey
×
P.Confirmation无性克隆苗个体PCR扩增的电泳图；其中M：Mark，A组1
‑
7是P.limprichtii
×
P.Snow Monkey；B组1
‑
7是P.Snow Monkey
×
P.Confirmation。
[0024]图4是不同浓度的模板DNA对ISSR
‑
PCR扩增的影响；其中，M：Marker，1
‑
4：60ng/μl，70ng/μl，80ng/μl，90ng/μl。
[0025]图5是不同退火温度对ISSR
‑
PCR扩增的影响；其中，M：Marker，1
‑
4：50℃，52℃，55℃，58℃。
[0026]图6是引物UBC 825对P.limprichtii
×
P.Snow Monkey组培苗个体PCR扩增电泳图
‑
重复实验结果1。
[0027]图7是引物UBC 825对P.limprichti本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定杂交独蒜兰幼苗一致性的ISSR
‑
PCR引物，其特征在于：所述引物的碱基序列表示如下：引物UBC825：5
′‑
ACA CAC ACA CAC ACA CT
‑3′
。2.一种用于鉴定杂交独蒜兰幼苗一致性的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物UBC825。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒反应体系总体积为50μL，含有2
×
Takara Taq 0.25μL、10
ꢀ×ꢀ
PCR Buffer 5μL、dNTP Mixtur 4μL、Template DNA 1μL、Primer 1.5 μL、其余为ddH2O；其中，模板DNA的浓度为80 ng/μL。4.一种杂交独蒜兰幼苗一致性的鉴定方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）提取待测样品DNA；（2）ISSR
‑
PCR扩增及电泳检测：采用如权利要求1所述的引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨露，张伟，张石宝，
申请(专利权)人：中国科学院昆明植物研究所，
类型：发明
国别省市：