H9N2禽流感HA1蛋白重组乳酸乳球菌载体的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种H9N2禽流感HA1蛋白重组乳酸乳球菌载体的构建方法，其技术方案包括下述步骤：1)目的基因片段合成及酶切鉴定；2)目的基因与表达载体pNZ8149酶切与连接；3)乳酸乳球菌感受态的制备；4)重组乳酸乳球菌的电转化；5)重组乳酸乳球菌NZ3900/pNZ8149

【技术实现步骤摘要】
H9N2禽流感HA1蛋白重组乳酸乳球菌载体的构建方法


[0001]本专利技术涉及医药
，更具体地，涉及一种H9N2禽流感HA1蛋白重组乳酸乳球菌载体的构建方法。

技术介绍

[0002]禽流感(Avian Influenza,AI)是由禽流感病毒引起的一种从轻微呼吸道症状到急性、败血性传染病综合征，几乎所有禽类均可感染。根据禽流感对鸡致病性不同，可以将禽流感分为高致病性禽流感和低致病性禽流感。H9N2亚型禽流感病毒(Avian InfluenzaVirus，AIV)是于1966年在美国火鸡中第一次被分离，在1992年，中国首次报告了H9N2亚型AIV，迄今为止，H9N2亚型AIV已传播到中国的绝大多数地区，并与H5和H7亚型一起，成为家禽中流行的主要亚型之一。H9N2亚型AIV是一种低致病性AIV，它不仅可以延缓家禽的生长，还会减少产蛋量，此外，H9N2亚型AIV在家禽中的感染也与其它呼吸道病毒的共同感染或继发感染有关，可导致高死亡率，并给中国养鸡业造成巨大经济损失。虽然H9N2亚型AIV主要在家禽中传播，但近年来又被证实其可通过重组为高致病性AIV提供基因片段，例如，在2013年上海、北京和其他省份爆发的疫情中，H9N2亚型AIV为H7N9亚型AIV提供了内部基因，这也是该病毒首次感染人类并导致死亡。除此之外，H9N2亚型AIV还提供多达七个基因片段进入禽流感基因组的其他亚型，包括H5N6、H5N2、H7N7、H10N8，由于H9N2的这种重排机制，使其与其他病毒共同感染后的基因片段交换将导致新的AIV基因群，极大地促进了它的传播，这将严重危害到人类健康以及家禽养殖。
[0003]H9N2亚型AIV属于正黏病毒科，A型流感病毒属，是单链负股RNA病毒。A型流感病毒含有八个基因片段，分别为PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS。依据其外膜血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)蛋白抗原性的不同，又可分为18种血凝素亚型(H1～H18)和11种神经氨酸酶亚型(N1～N11)，同时HA和NA也是抗流感病毒抗体反应的主要靶点。HA是病毒表面的钎突糖蛋白之一，分子量约为76KD，大约含有560个氨基酸，每个HA单体可分成两部分，一部分由HA1构成的球形头部，含有受体位点和抗原决定簇，大约由321个氨基酸组成；另一部分为茎部，由HA2和部分HA1组成，HA2大约由221个氨基酸组成，是参与细胞融合的重要亚单位。有研究表明针对HA头部保守或关键区域的抗体，涉及病毒生命周期的关键步骤，可以保护和中和流感病毒感染。综上所述，HA1可用于构建具有更广泛保护功效的流感疫苗。
[0004]目前，接种疫苗是中国控制H9N2亚型AIV最主要的预防和控制策略，但随着病毒抗原性的演变，疫苗的免疫保护效率不断受到挑战。随着H9N2病毒的进化，灭活疫苗诱导的特异性抗体无法有效阻止HA从病毒附着到靶细胞，这一过程导致现有疫苗的保护效力降低，并从接种高抗体滴度的鸡群中分离出了H9N2病毒。因此，针对H9N2亚型AIV中的HA蛋白研发流感疫苗非常重要。
[0005]乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)是人类胃肠道常见的菌之一，其参与调节机体胃肠道正常菌群生态平衡，是一种食品级的安全微生物。因为不具有侵染性和
致病性，而且经过修饰的L.lactis能够将外源蛋白有效地递呈给宿主黏膜免疫系统并激发免疫反应，近些年已经成为一种安全、有效﹑质量可控的细菌疫苗、基因治疗载体等进行广泛的研究。禽流感感染动物机体的主要途径是黏膜途径，而乳酸菌由于其可诱导黏膜免疫的特性而被关注，所以将HA1和L.lactis组合在起作为新型重组乳酸菌制剂，将会引起有力的免疫应答作用，本研究通过构建H9N2禽流感HA1蛋白重组乳酸乳球菌载体，为后续研制重组乳酸菌口服疫苗奠定基础。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种品级重组鸭坦布苏病毒E基因domainI
‑
II区蛋白乳酸乳球菌载体的构建方法，将E基因截短的domainI
‑
II区蛋白作为重组乳酸乳球菌口服载体疫苗，外源蛋白的表达量非常可观，为在实际生产条件下该疫苗的免疫效果研究提供数据支撑。
[0007]为此，本专利技术提供的技术方案是这样的：
[0008]一种H9N2禽流感HA1蛋白重组乳酸乳球菌载体的构建方法，依次包括下述步骤：
[0009]1)目的基因片段合成及酶切鉴定
[0010]按照乳酸菌表达体系对ML14
‑
HA1基因序列进行密码子优化，然后采用基于PAS的方法，按照乳酸乳球菌密码子的偏嗜性，合成目的基因ML14
‑
HA1，其核苷酸序列基因序列如SEQ IDNO：1所示，并在序列的5
‘
端起始位置加入信号肽；连入载体PMD18
‑
T的A位点得到重组质粒PMD18
‑
T
‑
ML14
‑
HA1，将获得的重组质粒PMD18
‑
T
‑
ML14
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HA1转入Top10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序；将PMD18
‑
T
‑
ML14
‑
HA1重组质粒用NcoⅠ、SacⅠ进行双酶切鉴定；
[0011]2)目的基因与表达载体PNZ8149酶切与连接
[0012]2.1)分别将PNZ8149载体质粒与PMD18
‑
T
‑
ML14
‑
HA1重组质粒用NcoⅠ、SacⅠ进行双酶切，37℃酶切2h，双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测；并切下正确条带用胶回收试剂盒对酶切产物进行回收纯化；
[0013]2.2)将目的基因ML14
‑
HA1与pNZ8149载体用T4连接酶连接过夜，反应条件为16℃；
[0014]3)乳酸乳球菌感受态的制备
[0015]4)重组乳酸乳球菌的电转化
[0016]将乳酸菌NZ3900感受态细胞置于冰上，待完全融化后，在感受态细胞中加入连接产物并轻轻混匀，冰上静置，转入提前预冷的电转杯中电转，电转结束后迅速用冰浴的电转复苏液中进行复苏，继续在冰上放置，然后静置后，将样品进行离心，弃去一部分上清，重悬菌体，涂布EM固体培养基，于30℃温箱内静置培养，待长出单克隆菌落后挑取单克隆菌落进行培养鉴定；
[0017]5)重组乳酸乳球菌NZ3900/pNZ8149
‑
HA1质粒的提取及鉴定
[0018]挑取单克隆菌落接种于5mL的EM液体培养基中，于30℃温箱内静置培养16h左右，以质粒小量提取试剂盒进行质粒提取；并将所提的重组质粒进行双酶切鉴定，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测；
[0019]6)重组乳酸乳球菌NZ3900/pNZ8149
‑
HA1诱导本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种H9N2禽流感HA1蛋白重组乳酸乳球菌载体的构建方法，其特征在于，依次包括下述步骤：1)目的基因片段合成及酶切鉴定按照乳酸菌表达体系对ML14
‑
HA1基因序列进行密码子优化，然后采用基于PAS的方法，按照乳酸乳球菌密码子的偏嗜性，合成目的基因ML14
‑
HA1，其核苷酸序列基因序列如SEQ IDNO：1所示，并在序列的5
‘
端起始位置加入信号肽；连入载体PMD18
‑
T的A位点得到重组质粒PMD18
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T
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ML14
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HA1，将获得的重组质粒PMD18
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T
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ML14
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HA1转入Top10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序；将PMD18
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T
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ML14
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HA1重组质粒用NcoⅠ、SacⅠ进行双酶切鉴定；2)目的基因与表达载体pNZ8149酶切与连接2.1)分别将pNZ8149载体质粒与PMD18
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T
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ML14
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HA1重组质粒用NcoⅠ、SacⅠ进行双酶切，37℃酶切2h，双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测；并切下正确条带用胶回收试剂盒对酶切产物进行回收纯化；2.2)将目的基因ML14
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HA1与pNZ8149载体用T4连接酶连接过夜，反应条件为16℃；3)乳酸乳球菌感受态的制备4)重组乳酸乳球菌的电转化将乳酸菌NZ3900感受态细胞置于冰上，待完全融化后，在感受态细胞中加入连接产物并轻轻混匀，冰上静置，转入提前预冷的电转杯中电转，电转结束后迅速用冰浴的电转复苏液中进行复苏，继续在冰上放置，然后静置后，将样品进行离心，弃去一部分上清，重悬菌体，涂布EM固体培养基，于温箱内静置培养，待长出单克隆菌落后挑取单克隆菌落进行培养鉴定；5)重组乳酸乳球菌NZ3900/pNZ8149
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HA1质粒的提取及鉴定挑取单克隆菌落接种于5ml的EM液体培养基中，于30℃温箱内静置培养16h左右，以质粒小量提取试剂盒进行质粒提取；并将所提的重组质粒进行双酶切鉴定，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测；6)重组乳酸乳球菌NZ3900/pNZ8149
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HA1诱导表达条件优化及Western blot鉴定目的蛋白诱导表达。2.根据权利要求1所述的H9N2禽流感HA1蛋白重组乳酸乳球菌载体的构建方法，其特征在于，所述的PMD18
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T
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ML14
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HA1重组质粒双酶切鉴定的反应体系包括下述组分和体积：PMD18
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T
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ML14
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HA1质粒3uL；NcoI 0.25uL；SacI 0.25uL；10x buffer 1uL；ddH2O 5.5uL。3.根据权利要求1所述的H9N2禽流感HA1蛋白重组乳酸乳球菌载体的构建方法，其特征在于，所述的pNZ8...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛叶，姚秋成，刘慧珍，
申请(专利权)人：广东海洋大学，
类型：发明
国别省市：