一种单细胞小片段染色体拷贝数变异的检测方法及系统技术方案

本发明专利技术涉及一种单细胞小片段染色体拷贝数变异的检测方法及系统，该系统包括胚胎单细胞的获得单元、胚胎样本全基因组扩增单元、亲本基因组样本获取单元、胚胎单细胞全基因组扩增产物及亲本基因组样本二代测序单元、单细胞测序数据过滤和比对单元、基于读段计数的基因组拷贝数分析单元、候选小片段CNV初筛单元、亲本及子代样本SNP位点等位基因型鉴定及SNP位点过滤单元、候选小片段CNV区域中SNP连锁读段的父源/母源倍率计算单元和真实小片段CNV判断单元。断单元。断单元。

【技术实现步骤摘要】
一种单细胞小片段染色体拷贝数变异的检测方法及系统


[0001]本专利技术涉及医学检测
，具体涉及一种单细胞小片段染色体拷贝数变异(CNV)的检测方法及系统。

技术介绍

[0002]胚胎着床前遗传学检测（PGT），指通过体外受精的方式获得胚胎，并活检少量胚胎细胞用于胚胎中遗传异常检测的一种手段。PGT通过遗传检测挑选不携带遗传异常的胚胎并移植，从而帮助患者生育健康后代。在PGT中，染色体疾病是临床上遇到的一种常见类型。针对染色体疾病，临床上目前发展出多种检测手段，主要包括高分辨率染色体核型分析、荧光原位杂交(FISH)、微阵列
‑
比较基因组杂交(aCGH)、PCR等。高分辨率染色体核型分析，通过获得大量有丝分裂晚前期或早中期的显带核型，从而识别染色体的数量和结构改变。但该技术的分辨率只有约5Mb，不足以检测更小的染色体微缺失或微重复异常，并且无法应用于单细胞；FISH利用核酸同源互补杂交的原理，针对染色体异常位点设计高度特异性探针，核酸探针与靶DNA位点杂交形成杂交复合物，通过检测探针发出的荧光即可对指定区域进行定性、定量和相对定位分析。FISH的分辨率理论上可达100Kb
‑
1Mb，但该技术需要在已知缺失或重复位点的情况下，才能设计探针进行检测，不能够发现新发的染色体异常，且相对耗时和昂贵；aCGH同样利用DNA杂交的原理，将靶探针固定在芯片上形成微阵列，将荧光素标记的待测DNA和参考DNA与芯片杂交，通过比较两者的荧光情况，直观地发现染色体CNV。该方法的分辨率取决于探针在芯片上分布的密度，但由于探针一般不能覆盖基因组的所有位点，且价格昂贵，不利于推广使用；PCR方法在临床上常用于检测染色体异常位点，该方法简单易行，但也只能对已知的染色体异常位点进行检测，且通量有限；近年来，临床上常用二代测序技术(NGS)对胚胎单细胞全基因组进行检测，利用算法推断CNV，CNV结果能够在一定程度上反映染色体缺失、重复等情况。目前PGT中常用10Mb的阈值报出CNV，对染色体异常的胚胎进行检出，然而，对于更小的CNV，在10Mb的CNV报出标准下可能无法识别，有赖于进一步调整提高CNV分辨率。由于实际临床诊断过程中胚胎活检所得的胚胎细胞量极少，需要先进行单细胞基因组扩增，从而获得足够的DNA用于遗传检测。但是，单细胞基因组扩增可能存在扩增不均匀、扩增序列偏倚的情况，目前仍缺少针对单细胞小片段CNV的检测方法。
[0003]本专利技术中的“小片段染色体异常”是指＜5Mb以下的染色体微缺失或微重复。针对小片段染色体异常的识别，目前主要的方法是对基因组测序数据进行测序深度、样本间等多层面的矫正。通过对正常样本数据进行分析，将基因组划分为几个窗口，建立各窗口读段数目概率矩阵，计算待测样本中各窗口的拷贝数状态，从而推断是否具有染色体的微缺失和微重复。这种方法是临床诊断中常用的一种主要的检测手段，但它具有一定的局限性，以连续m个窗口的拷贝数状态为推断染色体微缺失微重复的依据，对于小片段染色体异常的检出不具有优势。另外，由于基因组测序各窗口的读段数分布易受矫正方法和噪音的影响，检出结果容易出现假阳性。
[0004]因此，基于现有的染色体异常检测方法，对于小片段CNV的检出，需要进行进一步
的鉴定。
[0005]既往研究表明，长度<5Mb的小片段染色体异常与部分人类已知的神经发育类疾病、多发先天异常有关。由于小片段CNV引起的微缺失微重复综合征，其对于健康以及发育的影响取决于染色体异常发生的部位以及该部位涉及的基因数量。因此，在辅助生殖领域，部分患者在移植胚胎之前，需要对胚胎进行着床前染色体非整倍体检测（PGT
‑
A），若检出胚胎染色体异常，则需重新考虑是否能对胚胎进行移植。CNV结果能够在一定程度上反映染色体缺失、重复等情况，临床上常用的CNV报出标准为大于10Mb的染色体重复或缺失。然而，对于染色体变异较小的片段，在10Mb的CNV报出标准下可能无法检出，带来了可能的潜在风险。除此之外，由于实际胚胎检测过程中活检所得的胚胎细胞量极少，需要先进行单细胞基因组扩增，然而目前单细胞基因组扩增存在扩增不均匀、扩增序列偏倚的情况，目前缺少针对单细胞小片段CNV的检测方法。
[0006]现有技术中，已有专利CN104745718A公开的技术方案是首先在父方和母方的基因组上寻找是否存在染色体微缺失位点，获取缺失位点相应的SNV位点，而后在胚胎上判断是否携带父方或母方相应的染色体缺失。由于基因组上的位点众多，首先对父方和母方在全基因组范围内寻找异常位点，可能会影响分析的效率。另外，该方案只是选择目标位点的SNV位点进行分析，由于SNV位点可能是由于体细胞突变引起，在代际传递中可能不具有稳定性。再者，该方案受限于测序深度，在低深度测序情况下，可能无法得到足够多的SNV用于分析。
[0007]本申请中部分缩略语和关键术语的定义如下：PGT: Pre
‑
implantation Genetic Testing，胚胎植入前遗传学检测。
[0008]PGT
‑
A: Pre
‑
implantation Genetic Testing for Aneuploidy，胚胎植入前非整倍体遗传学检测。
[0009]CNV: Copy Number Variation，拷贝数变异。
[0010]FISH: Fluorescence In Situ Hybridization，荧光原位杂交。
[0011]aCGH: array
‑
based Comparative Genomic Hybridization，微阵列比较基因组杂交。
[0012]SNP：Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性。
[0013]SNP array: Single nucleotide polymorphism array，单核苷酸多态性微阵列芯片。
[0014]NGS: Next Generation Sequencing，二代测序。
[0015]WGA: Whole Genome Amplification，全基因组扩增。
[0016]MALBAC: Multiple Annealing and Looping
‑
based Amplification Cycles，多次退火环状循环扩增技术。
[0017]PCR: Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应。

技术实现思路

[0018]本专利技术旨在提供一种单细胞小片段CNV的检测方法和系统，所要解决的技术问题至少包括如何针对染色体小片段CNV，进一步提高检出的准确性。
[0019]为了实现上述目的，本专利技术提供一种单细胞小片段CNV的检测系统，包括胚胎单细
胞的获得单元、胚胎样本全基因组扩增单元、亲本基因组样本获取单元本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单细胞小片段染色体拷贝数变异的检测系统，其特征在于，所述的检测系统包括胚胎单细胞的获得单元、胚胎样本全基因组扩增单元、亲本基因组样本获取单元、胚胎单细胞全基因组扩增产物及亲本基因组样本二代测序单元、单细胞测序数据过滤和比对单元、基于读段计数的基因组拷贝数分析单元、候选小片段CNV初筛单元、亲本及子代样本SNP位点等位基因型鉴定及SNP位点过滤单元、候选小片段CNV区域中SNP连锁读段的父源/母源倍率计算单元和真实小片段CNV判断单元。2.根据权利要求1所述的单细胞小片段染色体拷贝数变异的检测系统，其特征在于，所述的胚胎单细胞的获得单元用于通过单精子注射的方式获得受精卵，培养至囊胚期，从每个囊胚期胚胎分离3至10个外滋养层细胞作为样本；所述的胚胎样本全基因组扩增单元优先使用多重退火环状扩增技术，进行胚胎细胞的全基因组DNA扩增；所述的亲本基因组样本获取单元用于抽取样本父方和/或母方外周血，提取其基因组DNA，进行全基因组DNA扩增，将扩增后的产物在
‑
20℃保存；所述的胚胎单细胞全基因组扩增产物及亲本基因组样本二代测序单元用于将所有样本使用二代测序仪测序；由于要同时获得CNV分析和SNP连锁信息，平均每个样本测序深度最低为基因组的2倍；所述的单细胞测序数据过滤和比对单元用于去除测序数据中的测序接头以及低质量碱基，然后将处理后的数据比对到人类参考基因组，进一步去除低比对质量序列、PCR重复序列，得到去除重复序列以后的唯一比对的读段；所述的基于读段计数的基因组拷贝数分析单元包括参考基因组窗口中比对读段数统计模块和多样本间矫正及单细胞基因组拷贝数可视化模块；所述的参考基因组窗口中比对读段数统计模块用于以200Kb的分辨率，将人类参考基因组分为若干个窗口，使用readCounter软件统计每个窗口的比对读段数；所述的多样本间矫正及单细胞基因组拷贝数可视化模块用于统计每个样本i比对的总碱基数，计算每个样本i的测序深度；得出每个样本i的每个窗口j经测序深度矫正后的读段数和样本间矫正因子以及经测序深度矫正以及多样本间矫正后的读段数，并进一步得到最终用于分析的窗口读段数，根据最终用于分析的窗口读段数的分布情况，绘制每个样本的CNV图；所述的候选小片段CNV初筛单元用于分析CNV图，获取初筛出的候选小片段CNV的染色体位置，作为候选区域，进行下一步的分析；所述的亲本及子代样本SNP位点等位基因型鉴定及SNP位点过滤单元用于对指定候选区域亲本及子代样本的SNP位点进行等位基因型鉴定，除去潜在错误的SNP；所述的候选CNV区域中SNP连锁读段的父源/母源倍率计算单元包括区分型SNP位点筛选模块和候选CNV区域中SNP连锁读段的父源/母源倍率计算模块；所述的区分型SNP位点筛选模块用于在相应候选区域，选取父母本为纯合且为不同碱基的SNP位点，作为能够用来区分父母源的SNP位点，即区分型SNP；区分子代样本相应候选区域的SNP位点等位基因分别是源于父方还是母方；所述的候选CNV区域中SNP连锁读段的父源/母源倍率计算模块用于获取子代单细胞样本在候选区域中分别来自父源和母源的SNP位点的读段数，计算SNP连锁读段父源/母源倍率Parental ratio； ；所述的真实小片段CNV判断单元用于判定Parental ratio >1.2或Parental ratio < 0.8的候选小片段CNV区域为真实小片段CNV，结合所述异常小片段CNV异常筛选单元的分析结果，其中C
i,j >2.3为小片段重复，或C
i,j
<1.7为小片段缺失。3. 根据权利要求1所述的单细胞小片段染色体拷贝数变异的检测系统，其特征在于，
所述的胚胎样本全基因组扩增单元进行胚胎细胞的全基因组DNA扩增的具体步骤包括：根据单细胞全基因组扩增试剂盒说明书，制备细胞裂解混合液，在样本中加入细胞裂解混合液，放入预热的PCR仪中进行裂解和失活蛋白酶；对获得的细胞裂解样本进行全基因组扩增，扩增的步骤包括：在细胞裂解样本中加入预扩增混合液，进行第一轮准线性扩增；线性扩增之后再加入扩增混合液，进行第二轮指数式扩增；将扩增后的产物进行纯化，并检测DNA浓度以判断扩增情况；最后将扩增后的产物在
‑
20℃ 保存。4.根据权利要求1所述的单细胞小片段染色体拷贝数变异的检测系统，其特征在于，所述的胚胎单细胞全基因组扩增产物及亲本基因组样本二代测序单元为了同时获得CNV分析和SNP连锁信息，平均每个样本测序深度最低为基因组的2倍。5.根据权利要求1所述的单细胞小片段染色体拷贝数变异的检测系统，其特征在于，使用的测序结果样本是自己测定的基于MALBAC扩增的人类基因组的测序数据，或是他人公开的基于MALBAC扩增的二代测序结果。6.根据权利要求1所述的单细胞小片段染色体拷贝数变异的检测系统，其特征在于，所述的多样本间矫正及单细胞基因组拷贝数可视化模块用于使用samtools软件统计每个样本i比对的总碱基数，计算每个样本i的测序深度depth
i
： ，其中，L为人类参考基因组碱基数；每个样本i的每个窗口j经测序深度矫正后的读段数为： ，其中，为样本i在基因组上第j个窗口比对上的读段数；样本间矫正因子Nor
j
为： ，其中，为样本i的基因组上第j个窗口上经样本测序深度矫正后的读段数，N为样本个数；在样本i的窗口j上，经测序深度矫正以及多样本间矫正后的读段数Cadj
i,j
...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔杰，严智强，张嘉琪，闫丽盈，朱小辉，马陌尘，关硕，阔瀛，魏瑗，
申请(专利权)人：北京大学第三医院北京大学第三临床医学院，
类型：发明
国别省市：